3.2 .Chỉ tiêu hóa sinh
3.2.1 .Xác định hàm lượng chất béo
4.2. Phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng E.Coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất
lớn nhất
4.2.1. Chỉ tiêu E.Coli
- Nguyên lý:
Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trƣờng tăng sinh chọn lọc và ủ 48 giờ ở 35°C. Các ống thu đƣợc cho thấy có sinh khí là ống chứa coliform giả định.
Để khẳng định E.coli, cấy tiếp vào ống đựng môi trƣờng EC và ủ ở 45°C trong 48h rồi tiếp tục cấy vào thạch L-EMB, ủ ở 45°C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ và thực hiện phép thử hình thái học và các phép thử sinh hóa.
- Dụng cụ, thiết bị: Theo bảng 2 phụ lục 1
- Xử lý mẫu: 50g mẫu đƣợc trộn đều để thu đƣợc các phần mẫu thử đồng nhất. - Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Phép thử E.Coli giả định:
Cân 50g mẫu vào bình trộn tốc độ cao hoặc thể dùng máy xay sinh tố cỡ nhỏ, khử trùng nƣớc nóng và sau đó là cồn cho mỗi lần sử dụng ở các mẫu khác nhau. Cịn nếu ko có thể sử dụng mẫu bỏ vào túi nilong, dùng búa đập nhẹ để trộn mẫu. Thêm 450ml dung dịch đệm phosphat Butterfield vô trùng và trộn trong 2 phút.
Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân bằng dung dịch pha loãng phosphat Butterfield vơ trùng. Số dung dịch pha lỗng cần chuẩn bị phụ thuộc vào mật độ
E.coli dự kiến. Lắc tất cả huyền phù 25 lần với biên độ 30cm hoặc dùng máy trộn Vortex
trong 7 giây. Không dùng pipet để phân phối thể tích nhỏ hơn 10% dung tích. Chuyển 1ml phần mẫu thử vào ba ống đựng canh thang LST đối với mỗi độ pha loãng đối với it nhất ba độ pha loãng liên tiếp. Giữ pipet với góc sao cho pipet thấp hơn cạnh dƣới đối diện của ống. Để pipet chảy trong 2 giây đến 3 giây. Thời gian từ khi trộn mẫu đến khi kết thúc cấy mẫu là không quá 15 phút.
Ủ các ống ở 35°C trong tủ ấm. Kiểm tra sự sinh khí của các ống sau 24 giờ ± 2 giờ, về sự thay đổi môi trƣờng trong ống Durham do lên men hoặc sự sủi bọt khi các ống
đƣợc khuấy nhẹ. Ủ thêm các ống âm tính trong 24h. Kiểm tra và ghi lại phản ứng sau 48 giờ ± 2 giờ. Thực hiện phép thử khẳng định trên tất cả các ống dƣơng tính giả định (có sinh khí).
Bƣớc 2: Phép thử khẳng định E.Coli:
Từ mỗi ống LST sinh khí trong phép thử giả định, chuyển một vòng cấy chứa đầy huyền phù vào ống đựng canh thang EC. Ủ các ống EC trong 24 giờ ± 2 giờ ở 45,5°C trong nồi cách thủy và kiểm tra sự sinh khí. Nếu âm tính thì ủ lại và kiểm tra ở 48 giờ ± 2 giờ.
Ống nghiệm thu đƣợc có sinh khí sau khi ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 45,5°C đƣợc coi là dƣơng tính với E. coli.
Bƣớc 3: Phép thử cuối cùng (completed test) đối với E.Coli:
Khuấy nhẹ mỗi ống EC sinh khí và đánh dấu đề phân lập, đƣa một vòng cấy vào đĩa thạch L-EMB và ủ trong tủ ấm trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ ở 35°C. Kiểm tra các đĩa nghi ngờ chứa các khuẩn lạc E. coli, là các khuẩn lạc có tâm tối màu, có hoặc khơng có ánh kim loại. Chuyển năm khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa L-EMB sang thạch nghiêng PCA, ủ trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ ở 35°C và dùng cho thử nghiệm tiếp theo.
Nếu nhận diện đƣợc bất kì một trong năm khuẩn lạc là E. coli là đủ để coi ống EC dƣơng tính; vì vậy, khơng nhất thiết thử cả năm khuẩn lạc.
Tiến hành nhuộm Gram để xem hình thể. Kiểm tra các tính chất sinh hóa sau đây (bốn phép thử đầu tiên gọi chung là IMViC) đối với các vi khuẩn hình que ngắn hoặc hình cầu bắt màu Gram âm.
Khả năng sinh indol
Phản ứng Voges-Proskauer:
Phản ứng với metyl đỏ:
Sử dụng xitrat:
Sinh khí từ lactose
Tất cả chủng cấy đƣợc coi là E. coli nếu:
Lên men lactose có sinh khí trong 48 giờ ở 35 °C, Xuất hiện dƣới dạng hình que ngắn hoặc hình cầu khơng sinh bào tử, bắt màu Gram âm, và cho IMViC (bốn phép thử đầu tiên) kiểu ++-- (dạng sinh học 1) hoặc -+-- (dạng sinh học 2).
- Tính tốn và biểu thị kết quả: Để kết quả có giá trị, thƣờng cần đếm các khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có chứa ít nhất 10 khuẩn lạc (Tổng số các khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc các khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí xác định). Tính số lƣợng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lƣợng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng công thức:
∑
Trong đó:
C: Là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên hai đĩa đƣợc giữ lại từ hai độ pha lỗng liên tiếp, trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;
V: Là thể tích chất cấy đƣợc đƣa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);
D: Là độ pha loãng tƣơng ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên đƣợc giữ lại. Nếu có nhiều hơn một độ pha loãng đƣợc sử dụng, tỷ lệ giữa số đếm khuẩn lạc của dung dịch pha loãng d2 và số đếm khuẩn lạc của dung dịch pha loãng d1 dự kiến là 10%.
- Thẩm định kết quả: 100 CFU/1g