3.2 .Chỉ tiêu hóa sinh
3.2.1 .Xác định hàm lượng chất béo
4.3. Phƣơng pháp MPN:
- Dụng cụ, thiết bị: Theo bảng 2 phụ lục 1 - Hóa chất, mơi trƣờng: Theo bảng 3 phụ lục 1
-Xử lý mẫu: Cân vô trùng 25g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu
lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225ml nƣớc pepton kiềm APW vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút.
- Thẩm định kết quả:
Bảng 16 Các số có xác suất lớn nhất (MPN) trên gam phần mẫu thử, sử dụng 3 ống có
các phần mẫu thử tƣơng ứng là 0,1 g, 0,01 g và 0,001g
Các ống dƣơng tính Các ống dƣơng tính Các ống dƣơng tính Các ống dƣơng tính
0, 1 0,0 1 0,00 1 MP N 0, 1 0,0 1 0,00 1 MP N 0, 1 0,0 1 0,00 1 MP N 0, 1 0,0 1 0,00 1 MPN 0 0 0 <3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 0 0 2a 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 0 0 3a 9 1 0 3a 15 2 0 3a 26 3 0 3a 95 0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 0 1 2a 9,2 1 1 2a 15 2 1 2 27 3 1 2 120 0 1 3a 12 1 1 3a 19 2 1 3a 34 3 1 3 160 0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 0 2 1a 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 0 2 2a 12 1 2 2a 20 2 2 2 35 3 2 2 210 0 2 3a 16 1 2 3a 24 2 2 3a 42 3 2 3 290 0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 0 3 1a 13 1 3 1a 20 2 3 1 36 3 3 1 460 0 3 2a 16 1 3 2a 24 2 3 2a 44 3 3 2 1100 0 3 3a 19 1 3 3a 29 2 3 3a 53 3 3 3 >110 0 a
Các kết quả không chắc chắn cao nhƣ thế muốn nói rằng có mặt các yếu tố làm ảnh hƣởng đến độ thu hồi hoặc nhận dạng đối với các dịch pha lỗng thấp hơn. Do đó, giá trị MPN có thể thấp hơn nhiều so với nồng độ thực.
4.3.1. Chỉ tiêuStaphylococcus aureus
- Nguyên tắc: Phƣơng pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
- Xử lý mẫu: Cân một cách vô trùng khoảng 50g mẫu thử chƣa rã đơng cho vào bình trộn vơ trùng. Thêm 450 ml dịch pha lỗng đệm phosphat và đồng hóa trong 2 phút ở tốc độ cao (từ 16000 vịng/phút đến 18000 vịngphút). Sử dụng dịch pha lỗng 1:10 này để chuẩn bị các dãy dịch pha loãng từ 10-2 đến 10-6 bằng cách chuyển 10ml pha loãng 1:10 vào 90 ml dịch pha loãng trắng, lắc mạnh để trộn kỹ và tiếp tục cho đến khi thu đƣợc dịch pha loãng 10-6.
- Cách tiến hành: Sau khi xử lý mẫu thì ta thực hiện
Bƣớc 1: Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất
Cấy vào 3 ống đựng canh thang trypticaza đậu tƣơng với NaCl 10% và natri pyruvat 1% ở mỗi độ pha loãng với các lƣợng 1 ml của dịch pha lỗng thập phân. Cần có đủ độ pha lỗng từ phần mẫu thử để có đƣợc điểm kết thúc âm tính. Ủ ấm trong 48 giờ ở 350C.
Sử dụng vòng cấy 3mm, chuyển 1vịng cấy từ mỗi ống phát triển dƣơng tính sang các đĩa đựng môi trƣờng Baird-Parker khô. Trộn các ống trên máy trộn Vortex trƣớc khi ria cấy nếu chỉ thấy mọc ở trên đáy hoặc bên thành ống. Ria cấy sao cho thu đƣợc các khuẩn lạc mọc tách biệt. Ủ 48 giờ ở 350C đến 370C.
Bƣớc 2: Khẳng định :
Đối với mỗi ống cho thấy có sự phát triển, lấy 1 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus. Dùng kim cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc sang các ống chứa
0,2ml canh thang BHI và các mặt nghiêng của thạch chứa môi trƣờng duy trì thích hợp bất kỳ. Giữ lại các chủng cấy trên ống thạch ở nhiệt độ phòng để dự phòng, hoặc lặp lại phép thử trong trƣờng hợp các kết quả thu đƣợc có nghi ngờ.
Cho 0,5ml huyết tƣơng coagulaza có EDTA hồn ngun vào dịch cấy BHI và trộn kỹ. Ủ ấm ở nhiệt độ từ 350C đến 370
C và cứ sau 6 giờ kiểm tra sự kết đông. Bất kỳ sự kết đông nào cũng đƣợc coi là phản ứng dƣơng tính. Các cục kết đơng nhỏ hoặc thƣa có thể quan sát đƣợc bằng cách gõ nhẹ ống sao cho phần chất lỏng của hỗn hợp phản ứng chạm tới miệng ống, các cục đơng sẽ lộ ra phía trên bề mặt chất lỏng. Các chủng dƣơng tính coagulaza đƣợc coi là S.aureus. Các phép kiểm chứng âm tính và dƣơng tính phải
đƣợc thực hiện đồng thời với các chủng cấy của khả năng phản ứng coagulaza chƣa biết. Kiểm tra lại các kết quả thử nghiệm coagulaza nghi ngờ trên các chủng cấy BHI đã đƣợc ủ ấm ở 350C đến 370C từ 18 giờ đến 48 giờ.
- Tính tốn và biểu thị kết quả: Tính số có xác suất lớn nhất (MPN) của S.aureus
trên 1 gam sản phẩm từ bảng 18 .
4.3.2. Chỉ tiêu Vibrio cholera, chỉ tiêu Vibrio parahaemolyticus
- Nguyên lý:
Các dãy dung dịch pha loãng của mẫu thử đƣợc cấy vào các ống môi trƣờng
lỏng chọn lọc nồng độ kép và nồng độ đơn;
Ủ ấm các ống ở 350
C trong 18 giờ đến 24 giờ trong điều kiện hồn tồn hiếu khí
Cấy các khuẩn lạc lấy từ các ống dƣơng tính giả định lên bề mặt mơi trƣờng đặc chọn lọc TCBS;
Ủ các đĩa này ở 350C trong khoảng từ 18 giờ đến 24 giờ. Quan sát và nhận biết khuẩn lạc trên thạch TCBS.
Các khuẩn lạc điển hình đƣợc khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa. - Cách tiến hành:
Mẫu thực phẩm đƣợc cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn trong điều kiện vô trùng cho tới khi đồng nhất. Đối với sản phẩm đông lạnh, phải rã đông trƣớc.
Cấy mẫu và ủ
Chuẩn bị huyền phù ban đầu 10-1
. Cân chính xác 50g mẫu thử (hoặc 50ml mẫu thử dạng lỏng) đã đƣợc chuẩn bị, cho vào bình nón canh thang STB chứa có chứa 3% NaCl. Lắc đều khoảng 2 phút đến 3 phút, thu đƣợc huyền phù ban đầu 10-1
. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo 10-2
, 10-3, 10-4,…Lấy chính xác khoảng 50 ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa sẵn 450ml canh thang STB có chứa 3 % NaCl. Lắc đều trong 2 phút đến 3 phút, thu đƣợc dung dịch 10-2. Tiếp tục quy trình pha lỗng nhƣ trên để thu đƣợc các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo: 10-3, 10-4…
Nuôi cấy: Dùng pipet vơ trùng lấy chính xác 10ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml mơi trƣờng GSTB nồng độ kép và 1ml huyền phù ban đầu cho vào 10ml môi trƣờng GSTB nồng độ đơn. Mỗi độ pha loãng cấy 3 ống. Lấy 1 ml dung dịch mẫu thử từ các độ pha loãng 10-2
, 10-3, 10-4, cho vào ống nghiệm chứa sẵn 10ml GSTB nồng độ đơn. Mỗi độ pha loãng cấy vào đĩa thạch TCBS. Ủ ấm ở 350
C trong 18 giờ đến 24 giờ.
Đánh dấu lên các đĩa thạch TCBS với nồng độ dung dịch mẫu thử tƣơng ứng.
Phân lập và nhận dạng
Lấy dịch cấy từ ống canh thang có độ pha lỗng cao nhất vẫn cho thấy có Vibrio cholerae phát triển, cấy sang các đĩa thạch TCBS. Ria cấy để tạo đƣợc các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Ủ ấm ở 35oC trong khoảng từ 18 giờ đến 24 giờ.
Các khuẩn lạc điển hình của Vibrio cholerae trên thạch TCBS: hình trịn, lồi, bờ đều, đƣờng kính từ 2mm đến 3mm, các khuẩn lạc có màu xanh do không lên men sacaroza, một số khuẩn lạc có tâm màu xanh sẫm. V.parahaemolyticus trơn nhẵn, có màu xanh (âm tính sacaroza), đƣờng kính từ 2 mm đến 3 mm.
Khẳng định: Chọn khuẩn lạc để khẳng định. Từ mỗi mơi trƣờng chọn lọc, lấy ra ít nhất năm khuẩn lạc đƣợc coi là điển hình, mỗi khuẩn lạc cấy đồng thời vào canh
thang TSB để xem di động và hình thể, cấy vào thạch TSA để thử khẳng định sinh hóa. Ủ ấm các mơi trƣờng đã ni cấy ở 35oC từ 18 giờ đến 24 giờ.
Hình 1 Sơ đồ cách tiến hành xác định chỉ tiêu Vibrio cholerae
- Thẩm định kết quả:
Vibrio cholerae: Khơng cho phép có mặt
Chƣơng 5 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN CỦA NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM