3.2 .Chỉ tiêu hóa sinh
3.2.1 .Xác định hàm lượng chất béo
4.1. Phƣơng pháp kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch petri
- Dụng cụ, thiết bị: Theo bảng 2 phụ lục 1. - Mơi trƣờng, hóa chất: Theo bảng 3 phụ lục 1.
- Tính tốn và biểu thị kết quả:
∑
Trong đó:
∑C: là tổng của các khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa đƣợc giữ lại thu đƣợc từ hai độ pha loãng liên tiếp và có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;
V: là thể tích chất cấy áp dụng cho mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);
n1 : là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
n2: là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
d: là hệ số pha loãng tƣơng ứng với độ pha loãng đầu tiên giữ lại, d =1 khi sản phẩm ở dạng lỏng không pha loãng (mẫu thử) đƣợc sử dụng.
4.1.1. Chỉ tiêu Coliform
- Nguyên lý: Vi khuẩn ở nhiệt độ quy định (nghĩa là ở 30°C hoặc 37°C ) hình thành các khuẩn lạc đặc trƣng trong thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể và trong phép thử khẳng định có lên men lactoza có sinh khí dƣới các điều kiện thử quy định.
- Xử lý mẫu: Cân vô trùng 1g mẫu thử, chính xác đến 0,1g, cho vào bình trộn vơ trùng của thiết bị trộn. Thêm 90ml nƣớc dùng để pha loãng và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên độ dao động 30cm) để thu đƣợc dung dịch pha loãng 10-1. Để yên trong 3 phút đến 5 phút và lắc ngay trƣớc khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và trƣớc khi cấy mẫu.
- Cách tiến hành:
Chuẩn bị hai đĩa đối với đối với mỗi bộ pha loãng đã chọn
Dùng pipet vô trùng cho vào tâm của mỗi đĩa 1ml của các dung dịch pha lỗng thích hợp.
Rót khoảng 15ml mơi trƣờng VRBL ở 44°C đến 47°C vào mỗi đĩa Petri. Trộn đều dịch cấy với môi trƣờng và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri ở một mặt phẳng ngang, mát.
Sau khi đơng đặc hồn tồn, rót khoảng 4 ml mơi trƣờng VRBL ở 44°C đến 47°C lên bề mặt của môi trƣờng cấy. Để cho đông lại nhƣ mô tả ở trên.
Lật ngƣợc các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm ở 30°C hoặc 37°C trong 24 giờ ± 2 giờ.
Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc. Có thể sử dụng bộ khuếch đại đƣợc rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ kèm theo một hoặc nhiều bọt khí (trong vịng đƣờng kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có màu đỏ nhƣng khơng có bọt khí khơng đƣợc coi là coliform. Khơng đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vịng trịn giới hạn của mơi trƣờng chọn lọc, khơng đếm các bọt khí giả có thể đƣợc tạo ra do thao tác chƣa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa.
4.1.2. Chỉ tiêu Salmonella
- Nguyên tắc: Salmonella có thể có mặt với số lƣợng nhỏ và thƣờng kèm theo một lƣợng khá lớn các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae hoặc các họ khác. Do đó cần tăng sinh sơ bộ để đảm bảo phát hiện một lƣợng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella bị suy giảm hoạt tính.
- Xử lý mẫu: Lấy đúng mẫu đại diện và khơng bị hƣ hỏng q trình vận chuyển và bảo quản -> Trộn (gộp) các phần mẫu thử-> Cấy phần mẫu thử vào dung dịch đệm pepton.-> Dập mẫu -> Cấy IRIS SALMONELLA
- Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu: Nếu khối lƣợng quy định của phần mẫu thử khác 25g, thì sử dụng một lƣợng cần thiết mơi trƣờng tăng sinh sơ bộ để có đƣợc dung dịch pha lỗng 1/10. Sử dụng mơi trƣờng tăng sinh sơ bộ và dung dịch đệm pepton làm dịch pha loãng.
Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc: Ủ huyền phù ban đầu ở 37 °C ± 1 °C trong 16 giờ ± 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc:
Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh thu đƣợc trong bƣớc 2 vào ống chứa 10 ml môi trƣờng RSV, chuyển 1 ml dịch tăng sinh thu đƣợc trong bƣớc 2 vào ống chứa 10 ml môi trƣờng MKTTn
Ủ môi trƣờng RVS đã cấy dịch tăng sinh ở 41,5°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ và môi trƣờng MKTTn đã cấy dịch tăng sinh ở 370C ± 10C trong 24 giờ ± 3 giờ. Cẩn thận không đƣợc để vƣợt quá nhiệt độ ủ tối đa (42,50
C).
Đỗ đĩa và nhận dạng:
Sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ, sử dụng dịch cấy thu đƣợc trong môi trƣờng RVS, dùng que cấy vòng cấy lên bề mặt của một đĩa Petri cỡ lớn chứa môi trƣờng chọn lọc đổ đĩa thứ nhất (thạch XLD) sao cho thu đƣợc các khuẩn lạc phân lập tốt.
Sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ, sử dụng dịch cấy thu đƣợc trong môi trƣờng MKTTn, lặp lại cách tiến hành .
Đối với môi trƣờng đổ đĩa thứ nhất, lật ngƣợc các đĩa sao cho đáy hƣớng lên trên và đặt chúng trong tủ ấm để ở 37°C. Đối với môi trƣờng đổ đĩa thứ hai, phải theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình và các khuẩn lạc khơng điển hình mà có thể nghi là Salmonella.
Đánh dấu các vị trí của chúng trên đáy đĩa. - Thẩm định kết quả:
Tên chỉ tiêu Mức giới hạn Tiêu chuẩn
n c m M
Salmonella 5 0 Không đƣợc có trong 25g ISO 4829:2005 + n: số đơn vị mẫu cần lấy
+ c: số mẫu có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vƣợt quá c là không đạt.
+ M: số mẫu có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vƣợt quá c là không đạt.
4.1.3. Chỉ tiêu Cl.perfringens
- Nguyên tắc:
Các đĩa Petri đƣợc cấy một lƣợng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lƣợng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Đối với các đĩa Petri khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Rót mơi trƣờng chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính mơi trƣờng này.
Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 37°C trong 20 giờ ± 2 giờ.
Định lƣợng các khuẩn lạc điển hình.
Khẳng định số lƣợng các khuẩn lạc điển hình và tính số lƣợng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.
- Xử lý mẫu: Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận đƣợc đúng mẫu đại diện và không bị hƣ hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
- Cách tiến hành:
Cấy và ủ (kỹ thuật rót đĩa)
Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu cho vào chính giữa hai đĩa Petri trống
Rót vào mỗi đĩa 10 ml đến 15ml thạch SC, đƣợc duy trì ở 44°C đến 47°C trong nồi cách thủy và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi mơi trƣờng đã đơng đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại thạch SC.
Để cho đông đặc lại. Đặt các đĩa vào các bình mơi trƣờng cải biến hoặc các vật đựng thích hợp khác và ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 20 giờ ± 2 giờ. Thời gian ủ kéo dài có thể làm cho các đĩa bị quá đen.
Tiến hành qui trình tƣơng tự đối với các dung dịch pha loãng đã chuẩn bị ddếm và chọn các khuẩn lạc
Sau giai đoạn ủ qui định, chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ các đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể.
Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.
Chọn năm khuẩn lạc điển hình và khẳng định chúng sử dụng một trong các kỹ thuật mô tả
Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trƣờng LS: Phản ứng thu đƣợc trong môi trƣờng lactoza sunfit khi ủ ở 46°C là rất đặc trƣng cho C.perfringens và C.absonum. Do
đó, khơng cần phải khẳng định sự thuần khiết của các khuẩn lạc màu đen đƣợc lấy từ môi trƣờng thạch trƣớc khi cấy vào môi trƣờng thioglycolat và cấy truyền vào môi trƣờng thạch lactoza sunfit nữa.
Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trƣờng thioglycollat lỏng . Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 18 giờ đến 24 giờ.
Sau khi ủ, dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trƣờng thioglycolat sang mơi trƣờng LS. Ủ trong các điều kiện hiếu khí ở 46°C trong 18 giờ đến 24 giờ trong nồi cách thủy
Giải thích kết quả: Kiểm tra các ống nghiệm đựng mơi trƣờng LS về việc sinh khí và có xuất hiện màu đen (kết tủa của sắt sunfit). Các ống Durham có phần bọt khí chiếm hơn một phần tƣ chiều dài ống và các ống có kết tủa màu đen đƣợc coi là dƣơng tính.
Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên mơi trƣờng thạch SC và đƣợc khẳng định dƣơng tính với mơi trƣờng LS đƣợc coi là C.perfringens. Trong các trƣờng
hợp khác, các ống đƣợc coi là âm tính.
- Thẩm định kết quả: Khơng quá 102/1g mẫu