3.1 .Chỉ tiêu hóa lý
3.1.5. Xác định hàm lượng Histamin
- Phƣơng pháp đo: Sử dụng phƣơng pháp đo huỳnh quang
- Nguyên lí: Mẫu đƣợc chiết bằng metanol 75 % (thể tích). Cho dịch chiết đi qua cột trao đổi ion. Bổ sung dung dịch o-phthaldialdehyd (OPT) vào dịch rửa giải nhằm tạo dẫn xuất huỳnh quang với histamin. Cƣờng độ huỳnh quang của các dẫn xuất đƣợc đo bằng máy đo huỳnh quang và hàm lƣợng histamin đƣợc định lƣợng, sử dụng chất ngoại chuẩn.
- Dụng cụ và thiết bị: Theo bảng 1 phụ lục 1. - Cách tiến hành
Để tránh bị mất nƣớc trong quá trình chuẩn bị và xử lý mẫu tiếp theo, nên sử dụng phần mẫu thử lớn. Giữ mẫu đã nghiền trong bình đậy kín khí. Tiến hành tất cả các phép xác định càng nhanh càng tốt. Nếu tiến hành chậm, nên làm lạnh phần mẫu thử để hạn chế sự phân hủy.
Dựng đƣờng chuẩn
Dùng pipet lấy hai phần dung dịch chuẩn làm việc histamin, mỗi phần 5ml cho vào các bình nón riêng rẽ. Lấy tiếp 10ml dung dịch axit clohydric 0,1M cho vào mỗi bình và trộn đều. Sau đó lại lấy tiếp 3 ml dung dịch natri hydroxit 1,00 M cho vào mỗi bình và trộn đều. Trong vòng 5 phút, lấy 1ml dung dịch o-phthaldialdehyd vào mỗi bình và trộn ngay. Sau đúng 4 phút, dùng pipet thêm 3ml dung dịch axit phosphoric 1,19M vào mỗi bình và trộn đều ngay. Cần trộn kỹ dung dịch sau mỗi lần thêm thuốc thử và ít nhất một lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch o-phthaldialdehyd.
Chuẩn bị mẫu trắng, dùng 5ml dung dịch axit clohydric 0,1M thay cho dung dịch chuẩn histamin.
Trong vòng 1,5 giờ, ghi lại cƣờng độ huỳnh quang (l) của dung dịch chuẩn làm việc histamin so với nƣớc trong cuvet so sánh, sử dụng máy đo huỳnh quang có bƣớc sóng kích thích 350nm và bƣớc sóng phát xạ 444nm. Dựng đồ thị của cƣờng độ huỳnh quang (đã đƣợc hiệu chỉnh đối với mẫu trắng) theo số microgam histamin trong 5ml dung dịch chuẩn làm việc histamin. Đƣờng chuẩn phải là đƣờng thẳng đi qua gốc tọa độ.
Chiết mẫu: Chiết mẫu đã đƣợc chuẩn bị bằng metanol 75% nhƣ sau. Chuyển 10g mẫu thử đã chuẩn bị vào bình bán vi lƣợng của máy nghiền, thêm khoảng 5ml metanol, trộn đều trong khoảng 2 phút. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức bằng thủy tinh dung tích 100ml, tráng nắp và bình bán vi lƣợng bằng metanol, cho nƣớc tráng vào bình định mức. Đun trong nồi cách thủy đến khoảng 600C và giữ ở nhiệt độ này trong 15
phút. Để nguội đến 250C, thêm metanol đến vạch rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết mẫu có thể bền đƣợc vài tuần khi đƣợc bảo quản trong tủ lạnh.
Cho 4ml đến 5ml nƣớc chảy qua cột và loại bỏ dịch rửa giải này.
Dùng pipet lấy 1ml dịch chiết mẫu cho lên cột và thêm từ 4ml đến 5ml nƣớc. Chuyển ngay dịch rửa giải vào bình định mức 50ml có chứa 5,00ml dung dịch axit clohydric 1,00M. Khi mức chất lỏng cao hơn lớp nhựa khoảng 2mm thì thêm khoảng 5ml nƣớc và rửa giải cột. Tiếp tục thêm nƣớc cho đến khi thu đƣợc khoảng 35ml dịch rửa giải. Khóa cột rồi thêm nƣớc đến vạch và trộn đều. Bảo quản dịch rửa giải trong tủ lạnh.
Dùng pipet lấy 5ml dịch rửa giải cho vào bình nón 50ml và bổ sung 10ml dung dịch axit clohydric 0,1M. Thêm 3ml dung dịch natri hydroxit 1,00 M cho vào bình nón và trộn đều. Trong vịng 5 phút, lấy 1ml dung dịch o-phthaldialdehyd vào bình và trộn ngay. Sau đúng 4 phút, dùng pipet thêm 3ml dung dịch axit phosphoric 1,19M vào bình và trộn đều ngay. Trộn kỹ dung dịch sau mỗi lần thêm thuốc thử và ít nhất một lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch o-phthaldialdehyd.
Nếu mẫu thử dự kiến chứa histamin lớn hơn 15 mg/100 g thì dùng pipet lấy 1ml dung dịch mẫu thử chứa o-phthaldialdehyd cho vào cốc có mỏ 10 ml chứa chính xác 2ml hỗn hợp mẫu trắng chứa o-phthaldialdehyd. Trộn kỹ. Đọc cƣờng độ huỳnh quang của dung dịch thu đƣợc.
Tỷ lệ phần thể tích giữa dung dịch mẫu thử và hỗn hợp mẫu trắng nhƣ trên cho biết độ pha loãng đúng của dung dịch mẫu thử trƣớc phản ứng o-phthaldialdehyd, dễ định lƣợng chính xác dung dịch thử. Sử dụng các tỷ lệ nêu trên để chuẩn bị độ pha lỗng thích hợp của dung dịch mẫu thử bằng dung dịch axit clohydric 0,1M. Thêm 3ml dung dịch natri hydroxit 1,00M cho vào cốc và trộn đều. Sau khoảng 5 phút, lấy 1ml dung dịch o- phthaldialdehyd vào cốc và trộn ngay. Sau đúng 4 phút, dùng pipet thêm 3ml dung dịch axit phosphoric 1,19M vào cốc và trộn đều ngay. Đọc cƣờng độ huỳnh quang của dung dịch mẫu thử và hiệu chỉnh đối với mẫu trắng.
Nếu đƣờng chuẩn khơng tuyến tính, dùng đƣờng chuẩn đó để xác định trực tiếp hàm lƣợng histamin có trong mẫu thử từ cƣờng độ huỳnh quang đo đƣợc. Khi đó, trục hồnh (nồng độ histamin trong dung dịch thử) cần chia vạch £ 0,1 mg/5 ml. Đọc tất cả các giá trị từ đƣờng chuẩn chính xác đến 0,05mg histamin trong 5ml dung dịch thử.
- Tính kết quả
Trƣờng hợp đƣờng chuẩn là tuyến tính: Hàm lƣợng histamin có trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên 100g (mg/100 g), đƣợc tính bằng cơng thức (1):
Hàm lƣợng histamin có trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên gam (mg/g), đƣợc tính bằng Cơng thức (2):
Trong đó:
F là hệ số pha loãng, trong trƣờng hợp mẫu thử dự kiến chứa histamin lớn hơn 15 mg/100 g,đƣợc tính theo Công thức (3):
Trong đó:
V1 là thể tích dung dịch mẫu thử (dịch rửa giải) thu đƣợc, tính bằng mililit (ml); V2 là thể tích dung dịch axit clohydric đã sử dụng, tính bằng mililit (ml).
(F = 1 đối với dịch rửa giải chƣa pha loãng).
m là độ dốc của đƣờng chuẩn, đƣợc tính theo cơng thức (4):
Trong đó
la , lb và lc là cƣờng độ huỳnh quang của dung dịch chuẩn làm việc histamin với nồng độ tƣơng ứng là 0,5 mg/5 ml; 1,0 mg/5 ml và 1,5 mg/5 ml.
Trƣờng hợp đƣờng chuẩn khơng tuyến tính: Trong trƣờng hợp này, hàm lƣợng histamin có trong mẫu thử đƣợc tính trực tiếp từ đƣờng chuẩn theo cƣờng độ huỳnh quang đo đƣợc.
Hàm lƣợng histamin có trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), đƣợc tính bằng cơng thức (5):
Trong đó
F là hệ số pha lỗng, đƣợc tính theo Cơng thức (3);
W là số microgam histamin trong 5 ml dung dịch thử đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn. - Thẩm định: Hàm lƣợng Histamin (mg/100g) ≤ 20