- Hệ thống enzym phõn huỷ ADN lạ xõm nhập và bảo vệ ADN bản thõn là hệ thống enzym giới hạn.
- Hệ thống enzym giới hạn (restrictase) cả hai loại hoạt tớnh enzym: endonuclease và methyltransferase. Cả hai thể hiện hoạt tớnh ở một đoạn xỏc định thứ tự phõn biệt.
1. Cỏc endonuclease giới hạn
Căn cứ vào khả năng nhận biết và vị trớ cắt đặc hiệu người ta chia enzym giới hạn làm 3 loại:
+ Enzym giới hạn Loại I được cựng 1 protein mang cả 2 hoạt tớnh, trỡnh tự nhận biết đặc hiệu, cắt ADN ngẫu nhiờn.
+ Enzym giới hạn Loại II cú endonuclease và methyltransferase được mang bởi 2 protein khỏc nhau, cú trỡnh tự nhận biết đặc hiệu, nằm trong vựng nhận biết, thể hiện sự đối xứng quay kộp, được sử dụng trong tạo dũng nhõn bản gen.
+ Enzym giới hạn Loại III được cựng một protein mang cả hai hoạt tớnh, cú vị trớ nhận biết đặc hiệu và cả vị trớ cắt cũng đặc hiệu.
Cỏc RE cắt đoạn ADN lệch đi tạo ra đầu dớnh (cố kết), cũn số enzym khỏc nếu cắt trờn cựng một vị trớ sẽ tạo ra cỏc đầu bằng (tự).
2. Thiết kế cỏc plasmid (vector) tỏi tổ hợp
-Nếu 2 loại ADN được xử lý với cựng 1 RE (restrictase) thỡ mỗi ADN sẽ cú đầu dớnh tương hợp nhau và
2 đoạn ADN sẽ gắn lại được với nhau tạo thành ADN duy nhất
Plasmid mà cú chứa 2 loại ADN cú nguồn gốc khỏc nhau được gọi là plasmid tỏi tổ hợp.
-Cú thể gắn gen của SV nhõn thật bậc cao vào 1 plasmid, theo cỏc bước sau: + Từ mụ vật chủ ta chiết lấy pre-mARN từ gen mục tiờu
+ Loại bỏ intron và ghộp nối exon ta được mARN trưởng thành.
+ Từ mARN trưởng thành nhờ enzym phiờn mó ngược tổng hợp cADN được ghộp với plasmid tạo
thành plasmid lai.
VITAMIN DƯỢC – TEAM HỌC TẬP TND 43 -Biến nạp: xử lý TB nhận với dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp (0-4ºC với E. coli), bổ sung plasmid TTH rồi đun núng TB nhận (tới 42ºC với E. coli) để gõy shock nhiệt chung => thay đổi tớnh thấm TB cho phộp plasmid xõm nhập
-Hoặc TB sau khi bị xử lý với shock điện (xung điện), shock điện tạo thành cỏc mao dẫn qua đú plasmid cú thể xõm nhập vào TB.
-Người ta sử dụng cỏc gen khỏng KS để làm dấu hiệu nhận biết TB đó dung nạp plasmid.
-Khi TB VK nhận plasmid TTH, TB sinh sản tạo thành 1 quần thể lớn cỏc TB giống nhau gọi là một dũng.
-Vỡ plasmid là tỏc nhõn biến truyền nhờ đú mà gen mới được đưa vào TB VK, nờn plasmid cũn được gọi là vector tạo dũng.
-Với một số plasmid, việc cho vào MT nồng độ thấp của chloramphenicol => sao chộp plasmid mất điều khiển khiến => hàng trăm bản sao plasmid được tổng hợp bởi mỗi TB VK => sự khuếch đại.