1. Chọn giống và cá thể để nhân giống in vitro
Khảo sát và xây dựng tập đoàn giống chuối in vitro. Trao đổi giống với mạng lưới nghiên cứu chuối quốc tế (INIBAP), chú trọng các giống chuối kháng bệnh Sigatoka cao. Cá thể được nhân giống cần khảo sát kỹ có bị nhiễm virus hay không bằng phương pháp Elisa và PCR, nhất là virus gây bệnh tóp ngọn (Bunchy top). Tiến hành các phương pháp khử virus trong chuối cấy mô để tránh lan tràn nguồn bệnh.
Nghiên cứu các đột biến soma, đặc biệt các đột biến lùn, thường gặp trong các cây chuối cấy mô và biện pháp giảm thiểu các đột biến này. Hiện nay, từ 1 củ chuối sau 7 lần cấy chuyền sản xuất 2000 cây bầu đất, trên số lượng này thường xuất hiện đột biến soma. Hướng giảm các đột biến là nhân phôi soma.
Quy trình sản xuất chuối sạch bệnh và virus
2. Ảnh hưởng các hoocmon lên sự sống còn của mô nuôi cấy
Để nhân giống in vitro thành công, sự phối hợp liều dùng các loại hoocmon là tối cần thiết. Tại mỗi giai đoạn khác nhau, nhu cầu của mô nuôi cấy đòi hỏi cung cấp các hoocmon với liều lượng khác nhau.
2.1 Ảnh hưởng hoocmon lên các giai đoạn sinh trưởng của mô cấy
Giai đoạn đầu: mô cấy thường nuôi trên môi trường MS đa khoáng, có bổ sung các yếu tố tái cấu trúc tế bào đã biệt hóa như IAA, BA, lượng lớn L-cystein (môi trường BI) Giai đoạn cảm ứng ra rễ và lá: thường sau 3-4 tuần, cần thay đổi môi trường nuôi trên bằng môi trường ½ MS và bổ sung lượng nhất định auxin/citokinin (A/C). Nuôi cấy mô chuối nói riêng hay trong nuôi cấy mô thực vật nói chung, tỉ lệ A/C cao hơn 1 sẽ kích thích ra rễ, và nhỏ hơn 1 kích thích tạo chồi. Citokinin thường dùng là BA hay BPA, kích thích tạo chồi, tuy nhiên lượng thấp citokinin (0.8mg /l) sẽ hỗ trợ auxin tạo rễ. Sử dụng loại auxin IAA/ IBA hay NAA tùy vào phương pháp nuôi cấy. Khi cần sự chính xác trong nồng độ sử dụng ta thường dùng IBA (dạng có hoạt tính cao của IAA) như trong phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng vì một nồng độ auxin cao sẽ kích thích tạo mô sẹo không cần thiết, trong khi ở nồng độ thấp (dưới 2 mg/l) IBA hỗ trợ citokinin tạo chồi. NAA được dùng trong những phương pháp ít đòi hỏi sự chính xác hơn khi cần tạo mô sẹo khi sử dụng các cơ quan đã biệt hóa của mô chuối.
Mẫu vật sẽ được kích thích ra chồi trước bằng môi trường ½ MS bổ sung BA, lượng nhỏ L-cystein: 1g /l (môi trường shifting B) trong khoảng 30 ngày. Trong thời gian này, bổ sung vào môi trường với lượng tăng dần các hoocmon giúp làm cứng cây. Sau đó, cây được kích thích ra rễ với ½ môi trường MS bổ sung 1% saccar, 1- 2 mg/l NAA và 2 g/l BAP hay sử dụng môi trường BNIT trong 1.5 – 2 tuần (.
Giai đoạn tạo cụm chồi bắt đầu, thường dùng môi trường MS có bổ sung và gibberellin (GA 3) (môi trường BT) là cần thiết để kích thích tạo và kéo dài chồi, lóng. Tác dụng của GA trên mô chuối được ghi nhận như chất kích thích bẹ lá mở ra, tránh cản đường sinh trưởng của mô phân sinh ngọn.
Nuôi in vitro chuối Musa sp.
a): cơ quan cấy trên môi trường MS (BI), b): Kích thích cảm ứng c): Mẫu cấy sau 4 tuần nuôi
d) Cảm ứng phát triển lá e): cảm ứng phát triển rễ
f): Trồng chuối trong đất, sau khi làm cứng cây trồng (phytagel)
2.2 Ảnh hưởng của hoocmon lên quá trình làm cứng cây
Trong quá trình tạo cây con, cần làm cứng nó trước khi đem trồng bằng các hoocmon vì chuối non in vitro rất dễ bị tấn công bởi các sâu bệnh và sức thích nghi với môi trường thường kém hơn nuôi trồng truyền thống.
Hiệu lực của hoocmon L-1 trong sự làm cứng ở cây chuối con Musa sp (giai đoạn tạo chồi). A): Bổ sung môi trường với 2,0 g L-1
B): Cảm ứng trên trung kiên cố hóa với 3,60 g L-1 C-D): Cây con phát triển cứng cáp
3. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sức sống của cây chuối con in vitro
Cây chuối được nhân trồng in vitro dưới tác động của ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên (điều kiện bán tự nhiên) thường có lá rộng hơn và ngả màu xanh đậm hơn so với nhân trồng dưới hệ thống đèn nhân tạo và điều kiện phòng máy lạnh.
Mô chuối phát triển dưới các điều kiện sáng A, B trồng dưới ánh đèn; C, D trồng dưới ánh sáng tự nhiên
Thực tế cho thấy, những cây trồng điều kiện bán tự nhiên có sức sống cao hơn, có lẽ do được thích ứng dần trong quá trình sinh trưởng