1. Phương pháp nhân giống từ mẫu đã hủy đỉnh sinh trưởng
Cây chuối trồng in vitro theo phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng
1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bằng phương thức hủy đỉnh. Cây chuối con 4 tháng tuổi được lấy ngoài đồng ruộng, củ chuối được cắt nhỏ gọn có chiều dài 25 cm, vỏ ngoài được tách chừa 5 lớp bên trong. Củ chuối được khử trùng bằng Na-hypochlorit, sau đó mẫu được lau sạch bằng bông có thấm nước cất vô trùng, mẫu được tách cẩn thận bằng dao mỏng và sắc, vỏ được tách cho đến 3 lớp vỏ cuối cùng thì ngưng tách, loại các bao lá, gọt sạch các chân lá, chừa lại vòm đỉnh sinh trưởng.
Củ chuối được khử trùng và được tách bóc vỏ
Nếu tách đỉnh sinh trưởng ra nuôi cấy riêng biệt thì chỉ được 1 chồi, nếu hủy đỉnh thì các chồi ở nách các bao mất ưu thế ngọn, phát sinh thành nhiều chồi. Kích thước mẫu được tách có đường kính 1-1,5cm, dày 0,7-1,3cm. Mẫu sau khi tách được cấy vào bình tam giác 300ml chứa môi trường MS bổ sung BA (5 ppm), IAA (0.5 ppm), tyrosin (100 ppm), nước dừa 15%. Sau khi cấy, mẫu được đặt trong phòng dưỡng cây có nhiệt độ 25-28 độ C, cường độ chiếu sáng 3000 lux, ẩm độ 70-80%, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày. Sau 45 ngày chồi xuất hiện và vươn cao khoảng 3 cm, mỗi mẫu cấy bình quân phát sinh 5-8 chồi.
1.2 Tạo và nhân cụm chồi:
Các chồi tái sinh trên mẫu được tách riêng rẽ từng chồi một, mỗi chồi đơn lại được tách lá bao và hủy đỉnh, chồi đơn được cấy trong bình tam giác có chứa môi trường tạo chồi. Môi trường tạo chồi và điều kiện nuôi cấy giống như bước 1. Sau 30 ngày, từ 1 chồi đơn phát triển thành 1 cụm chồi (có 3-4 chồi nhỏ).
Cụm chồi có từ 3-4 chồi nhỏ được cấy vào môi trường nhân chồi. Môi trường nhân chồi cũng giống như môi trường tạo chồi nhưng có nồng độ BA (2-3 ppm), IAA (0.2- 0.3 ppm). Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền là 3 tuần (21 ngày). Số lần cấy chuyền là 7 lần. Hệ số nhân giống bình quân là 3chồi/1 lần cấy chuyền. Phương pháp hủy đỉnh vẫn duy trì trong giai đoạn nhân chồi, chồi to được hủy đỉnh và chồi nhỏ được giữ thành cụm 2-3 chồi. Sau 7 lần cấy chuyền nhân chồi, từ 1 củ chuối ban đầu cho 2000 cây chuối in vitro.
Nhân cụm chồi
2. Phương pháp nhân giống từ căn hành được hơ nóng (Jona vàRoberto, 1987) Roberto, 1987)
Các căn hành được lấy từ giống chuối không tạo trái nữa. Căn hành được đặt vào các hộp gỗ đặc biệt có những lành để chôn 2/3 căn hành vào đó. Đem các hộp này đặt vào
Các mầm bên sẽ phát triển sau 100 ngày xử lý hơi nóng, lấy căn hành ra rồi cắt thành từng miếng mô phân sinh (meristems). Các mô phân sinh này được khử trùng sau đó cho vào môi trường cơ bản có chứa các chất kích thích NAA.
Khi thấy các cây con bắt đầu tạo được lá và rễ, sự sinh trưởng tiếp tục, kế tiếp có thể trồng chúng sang chậu có hỗn hợp đất và cát. Trước khi trồng, giữ cây con trong môi trường chất lỏng vô trùng chứa môi trường cơ bản và thêm 5,5 µM NAA.
Sau 2-3 tháng nuôi cấy, rễ bắt đầu xuất hiện. Sau 3-4 tháng, trồng ra chậu.
3. Phương pháp nhân giống từ phôi hạt
Phôi của hạt chuối được đặt trong môi trường cây, khi cây phát triển đến một kích cỡ nhất định thì được đem ra ngoài môi trường trồng trong bầu đất.
4. Phương pháp nhân giống từ củ thân ngầm
Mẫu cấy là các mắt, mẫu có dạng hình vuông, chiều dài từ 1-2 cm, có chứa đỉnh sinh trưởng đã được khử trùng cẩn thận. Mẫu được chuyển vào môi trường nuôi cấy sau 4-6 tuần, các mẫu cấy sẽ cho ra nhiều chồi, ta tiếp tục cấy chuyền nhiều lần. Sau những lần cấy chuyền, tách các chồi có rễ sang môi trường nuôi cấy. Sau 3-4 tuần, cấy chuyền các cây này ra bầu đất.
5. Phương pháp nhân giống từ lá của những cây được trồng trong ống nghiệm (Bakry và Rossignol, 1985)
Thí nghiệm trên cây “Americani” thuộc nhóm “Cavendish”. Các mẫu dinh duỡng của cây như mảnh lá (bao lá, cuống lá hay phiến lá) mỗi cạnh từ 8-10 mm và các đoạn rễ dài 1 cm được đặt trong môi trường căn bản và để ngoài sáng. Tùy môi trường chúng ta làm thay đổi trạng thái mẫu cấy trên.
6. Phương pháp nhân giống từ chồi phát hoa (bắp chuối) (Bakry,Lavarde, GuiGward, Rossignol và Demarly, 1985) Lavarde, GuiGward, Rossignol và Demarly, 1985)
\Sử dụng chồi dinh dưỡng của phát hoa đực, phát hoa là một hình bông bò cạp, bầu nhụy giảm 1/3 chiều dài, một vòi và các nuốm bị trụy, trong khi các nhụy đực phát triển đầy đủ. Các hoa cao cỡ 5 mm và bầu nhụy 2 mm. Càng gần ngọn của bông thì các hoa ở nách lá bắc càng nhỏ dần cho đến khi chỉ còn là các nụ hoa đầu ngọn thì không còn thấy nụ hoa.
Mẫu cấy được khử trùng bằng côn 90o. Sau khi khử trùng, bỏ các chồi đực cho đến khi
đạt kích thước cuối cùng là 3-5 cm. Cắt dọc mẫu cấy thành 4 phần, mỗi phần được đặt đứng trên môi trường. Nuôi trong tối (hạn chế sự oxi hóa các hợp chất phenol) trong 3-
4 tháng ở 27oC và 70% độ ẩm, kế đó chuyển ra sáng 16g một ngày. Sau khi đưa ra
sáng, các mẫu cấy sơ khởi này được cấy lại đều đặn cứ 7 tuần một lần trên môi trường MS chứa các chất điều hòa sinh trưởng có tỉ lệ khác nhau, để quan sát sử sản xuất các chồi dinh dưỡng. Các chồi này lúc xuất hiện sẽ lần lượt được phân lập và cấy lại trên môi trường cơ bản, để ngoài sáng.
Sau 2 tháng, có sự hoạt hóa hầu hết các mô của chúng. Dấu hiệu của sự hoạt hóa là các bộ phận hoa (bao hoa, bầu nhụy, nuốm, bao phấn) sẽ phì đại lên và các mô ở nạch lá bắc non nhất nơi chưa có một hoa nào tượng hình sẽ phồng lên. Ngược lại, lá bắc không phản ứng sẽ hóa đen, chai cứng rồi chết.
Sau 3-4 tháng nuôi cấy, chồi dinh dưỡng dừng phát triển trên các mảnh cấy sơ khởi và cũng có trên các mẫu cấy lại. Tùy trạng thái phân hóa hướng đến giai đoạn trổ hoa của mẫu cấy ta có 4 phương thức để phát sinh khác nhau.
• Đảo nghịch sinh mô tận ngọn của phát hoa hoặc một phần của sinh mô
này trở lại một hoạt động dinh dưỡng.
• Tân tạo trực tiếp các sinh mô thân, dinh dưỡng từ các mô ở nách non
• Đảo nghịch các nụ hoa đã khởi nguyên ở nách, các lá bắc già hơn trở lại trạng thái dinh dưỡng nụ hoa càng phát triển thì sự đảo nghịch càng trễ, nếu nụ hoa cùng ở một giai đoạn phát triển khá xa.
• Tân tạo trực tiếp các sinh mô thân dinh dưỡng từ các mô nằm kế gốc các
hoa đực đã phát triển hoàn toàn ở nách lá bắc già hơn nữa của mẫu cấy.