CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính
sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang.
Mục đích: thí nghiệm này nhằm xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy như thời gian, loại môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nồng độ cyclodextrin bổ sung vào môi trường, pH môi trường và điều kiện có hay khơng có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol đến sự sinh Aflatoxin tương ứng với sự phát huỳnh quang của các chủng A. flavus.
Cách thực hiện:
Chọn các chủng A. flavus sinh Aflatoxin va các chủng A. flavus không sinh
Aflatoxin đã được kiểm tra đối chứng bằng HPLC.
Quan sát kèm với 1 đĩa thạch đối chứng âm không bổ sung cyclodextrin và 1 đĩa âm cấy chủng A. oryzae.
2.2.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian:
Cấy các chủng A. flavus lên mơi trường SAB có bổ sung 0,3 % methyl -β
cyclodextrin; ủ 28oC trong 3, 5, 7, 9 ngày. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
2.2.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy nấm mốc:
Cấy các chủng A. flavus lên mơi trường SAB, PDA, Czapek dox, DG18,
YES agar có bổ sung 0,3 % methyl-β-cyclodextrin; ủ 28oC trong khoảng thời gian
ngắn nhất dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
2.2.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ:
Cấy các chủng A. flavus lên môi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh
hưởng của mơi trường) có bổ sung 0,3 % methyl -β cyclodextrin; ủ (22, 25, 28 và
của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
2.2.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH:
Cấy các chủng A. flavus lên mơi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh
hưởng của môi trường) được điều chỉnh pH từ 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; có bổ sung 0,3 % methyl-β-cyclodextrin; ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
2.2.6.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin bổ sung vào môi trường:
Cấy các chủng A. flavus lên môi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh
hưởng của mơi trường) được điều chỉnh pH thích hợp nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát pH); có bổ sung (0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5) % methyl-β-cyclodextrin; ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
2.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh Chloramphnicol bổ sung vào môi trường:
Cấy các chủng A. flavus lên mơi trường có và khơng có bổ sung Chloramphenicol 40ppm (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi
trường) được điều chỉnh pH thích hợp nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát pH); có bổ sung nồng độ methyl-β-cyclodextrin phù hợp (dựa trên thí nghiệm khảo sát nồng độ cyclodextrin); ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm).
Ở mỗi điều kiện nuôi cấy, ủ kèm đĩa đối chứng âm không bổ sung methyl-β- cyclodextrin vào môi trường nuôi cấy và đĩa đối chứng âm cấy chủng A. oryzae
không sinh độc tố.