Phát hiện Aspergillus flavus sinh Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang.
1. Phạm vi áp dụng:
Phương pháp này được dùng để định tính A. flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ
cốc .
2. Định nghĩa:
Nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin: là những khóm nấm mốc có đường kính d = 3 cm trên thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin sau 3 ngày, xung quanh khuẩn lạc phát huỳnh quang màu xanh lam. Khóm nấm lúc đầu hơi vàng, cuối cùng trở nên xanh lục hoặc vàng lục. Bông lớn hình cầu, tỏa tia. Bọng hình cầu đến gần cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số lồi thể bình 2 tầng. Vách cuống đính bào tử xù xì. Hạt đính hình cầu đến gần cầu, có gai.
3. Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu xác định vào đĩa petri, đổ đĩa và ủ đĩa trong tối, ghi nhận khuẩn lạc đặc trưng trên thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin. Cấy chuyển riêng lẻ từng khuẩn lạc nghi ngờ sang mơi trường thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin để quan sát rõ hơn về việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc và để lấy mẫu làm tiêu bản quan sát sơ bộ hình thái nấm.
4. Môi trường và thuốc thử:
Saline Peptone Water (SPW): Sabouraud agar (SAB)
Kháng sinh Chloramphenicol Methyl-β-cyclodextrin
5. Thiết bị Tủ ấm 28oC±1oC Bàn đọc UV (365nm) Kính hiển vi 6. Quy trình: 6.1 Chuẩn bị mẫu:
Cân 25 gam mẫu và thêm 225 ml dung dịch pha loãng SPW. Ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 10 phút. Đồng nhất mẫu 2 phút bằng máy dập mẫu. Thời gian thử nghiệm không quá 5 phút sau khi dập mẫu.
6.2. Đỗ đĩa:
Chuẩn bị các nồng độ pha lỗng thích hợp. Cấy 1 ml dịch mẫu pha lỗng vào 2 đĩa petri vơ trùng. Thêm 15 ml mơi trường thạch SAB có bổ sung 0,3 methyl-β- cyclodextrin được làm nguội ở 45oC. Trộn đều mẫu bằng cách xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và chiều ngược lại. Để môi trường đông lại.
6.3. Ủ đĩa:
Dùng giấy bạc gói kín đĩa, đặt ngữa đĩa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc và hạn chế làm khô thạch. Ủ các đĩa ở 28oC±1oC trong 3 ngày.
6.4. Đọc kết quả:
Chọn các đĩa có khuẩn lạc điển hình màu vàng hơi lục, đường kính 3cm, có vịng phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dưới đèn UV có bước sóng 365nm. Đồng thời lấy mẫu làm tiêu bản để quan sát sơ bộ hình thái của nấm mốc như cuống đính bào tử, bào tử, bọng, thể bình… Nếu nấm mốc mọc dày đặc trên đĩa, khó quan sát, có thể cấy các khuẩn lạc nghi ngờ (có màu vàng lục) sang đĩa thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin khác để quan sát rõ hơn.
Kết quả được ghi nhận: phát hiện hoặc không phát hiện nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin trên 25 g mẫu.