CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14]
Quy trình thực hiện: gồm các bước chính như sau:
Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus flavus trên môi trường PDA ở 28oC trong 7 ngày cho đến khi bào tử được tạo ra.
Dùng que cấy móc, lấy tồn bộ bào tử của nấm mốc cho vào nước muối sinh lý (SPW), vortex đều và để yên trong vòng 3 phút, hút dịch chứa bào tử cho vào ống muối sinh lý khác để đảm bảo trong dung dịch chứa duy nhất bào tử nấm mốc.
Pha loãng dung dịch chứa bào tử nấm mốc đến nồng độ thích hợp và cấy 1ml dịch pha lỗng ở mỗi nồng độ đã chọn vào các đĩa petri, mỗi nồng độ cấy 3 đĩa. Đổ 15 ml môi trường SAB vào các đĩa vừa cấy, lắc đều. Dùng giấy sạch gói các đĩa lại. Ủ đĩa ở 28oC, 3 ngày. Bảo quản các ống dịch pha loãng chứa bào tử nấm mốc trong tủ mát ở 2-8oC.
Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15-150 cfu/đĩa. Tính ra mật độ tế bào ở ống dịch pha loãng chứa bào tử nấm mốc gốc và các ống dịch pha loãng tương ứng.
Chuẩn bị mẫu: mẫu đã được kiểm tra bằng quy trình phân tích nấm mốc
Aspergillus flavus của FAO (1992) [10] và khẳng định là không nhiễm Aspergillus
flavus. Cân 25g mẫu vào bao PE vơ trùng, pha lỗng mẫu với 225g SPW. Ngâm
trong 5 phút. Dập mẫu 1-2 phút, tốc độ 200 vòng/phút.
Gây nhiễm mẫu: Từ ống gốc nước muối sinh lý chứa bào tử đã xác định được mật độ bào tử nấm mốc, tính tốn độ pha lỗng và thể tích dịch bào tử cần lấy để đưa vào mẫu. Đồng nhất để huyền phù bào tử phân bố đều trong dịch mẫu.
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình gây nhiễm bào tử nấm mốc vào mẫu.
10ml SPW 9ml SPW 1ml 1ml Bảo quản ống gốc SPW chứa bào tử trong tủ mát
Đổ đĩa với thạch SAB. Ủ 28oC/ 3 ngày Chọn đếm những đĩa có 15-150 cfu/đĩa. Xác định mật độ bào tử trong ống dịch SPW 25g mẫu Mẫu đồng nhất 225g SPW
Gây nhiễm vào mẫu ở mật độ mong muốn 10o 10-1 10-5 10-6 10-