4.1. Kết luận
- Môi trường thạch SAB với giá trị pH 5,6 có bổ sung 0,3% methyl-β- cyclodextrin và 40ppm kháng sinh Chloramphenicol là môi trường tối ưu cho phép phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 dưới đèn UV (365nm) ở điều kiện nuôi cấy 28oC, 3 ngày.
- Phương pháp “Phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 dưới đèn UV
(365nm)” có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp phát hiện A. flavus hiện
tại như: cho phép phân biệt A. flavus sinh độc tố hay không sinh độc tố, qui trình thực hiện đơn giản hơn, thời gian phân tích ngắn hơn.
- Các thơng số xác nhận hiệu lực sơ cấp: giới hạn phát hiện là 5-8 cfu/g; độ nhạy là 97%; độ đặc hiệu 93%; tỷ lệ âm tính giả 3,4%; dương tính giả 6,5%. Với các thông số như trên cho thấy phương pháp này bước đầu có thể đáp ứng các yêu cầu để áp dụng vào việc phát hiện A. flavus sinh độc tố
Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi.
4.2. Đề nghị:
Do hạn chế về thời gian, vì vậy, chúng tơi xin có một số kiến nghị cho những nghiên cứu tiếp theo như sau:
- Khảo sát sự ổn định của phương pháp được xây dựng.
- Xác định các thông số của phương pháp trên nhiều nền mẫu khác như trà, gạo, gia vị…để mở rộng phạm vi áp dụng phương pháp.
- Bố trí thực nghiệm khảo sát ngưỡng phát hiện Aflatoxin trên mơi trường SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. 52 TCN-TQTP 0001:2003, Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm.
2. Dương Thanh Liêm (2003), “Độc tố nấm mốc, kẻ thù số một của thức ăn công nghiệp”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, (số 1) năm
2003, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.
3. Đặng Vũ Hồng Miên (1980), Nấm mốc độc trong thực phẩm, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4. Lương Đức Phẩm (2002), Vi sinh vật và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Nơng nghiệp.
5. Nguyễn Minh Trí (2006), “Tình hình nhiễm độc tố nấm (Aflatoxin B1, Ochratoxin A, Citrinin) trên gạo tại Nha Trang”, Tạp chí khoa học Công
nghệ thủy sản, (số 02) năm 2006, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
6. Nguyễn Thị Hiền và cộng tác (2003), Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực
– thực phẩm, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
7. Nguyễn Thị Xuyến (1999), Vi sinh vật thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
8. Trương Quốc Phú, Nguyễn Anh Tuấn, Dương Thúy Yên, Phạm Trần Nguyên Thảo, Trần Thị Thanh Hiền, Nguyễn Quốc Thịnh (2005), Ảnh
hưởng của aflatoxin lên tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của cá tra, Báo cáo
khoa học, Đề tài cấp bộ, Mã số đề tài: B-2003-31-51, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Thủy sản.
Tiếng Anh
9. Alessio Amadasi, Chiara Dall′Asta, Gianluigi Ingletto, Roberto Pela, Rosangela Marchelli and Pietro Cozzini (2007), Explaning cyclodextrin-
mycotoxin interactions using a “natural” force fiel, Bioorganic & Medicinal
Chemistry (15) 4585–4594, Elsevier Ltd.
10. FAO 1414-1992. Manual microbiological analysis in the food control
laboratory.
11. Fente C.A., Ordaz J.Jaimez, V¸zquez B. I., Franco C. M. (2001), New Additive For Culture Media For Rapid Identification of Producing Aspergillus Strains, Applied and environmental microbiology, Oct. 2001, p.
4858–4862 Vol. 67, No. 10, Copyright © 2001, American Society for Microbiology.
12. Goryacheva I. Yu., Rusanova T.Yu., and Pankin K.E. (2007), Fluorescent Properties of Aflatoxin in Organized Media Based on Surfactants, Cyclodextrins, and Calixresorcinarenes, ISSN 1061-9348, Journal of
Analytical Chemistry, Vol. 63, No. 8, pp. 751–755. © Pleiades Publishing, Ltd., 2008.
13. Harold J.Benson (2002), Microbiological Applications, Eighth edition,
Exclusive rights by The McGraw-Hill Companies.
14. ISO 16140:2003. Microbiolgy of food and animal feeding stuff-protocol for
validation alternative methods. 1st ed. 2003-05-01.
15. Mohammad Aghamohammadi, Naader Alizadeh (2007), Fluorescence enhancement of the aflatoxin B1 by forming inclusion complexes with some cyclodextrins and molecular modeling study, Journal of Luminescence
Volume 127, Issue 2, December 2007, Pages 575-582, Elsevier B.V.
16. Pitt J.I. and Hocking A.D. (1999), Fungi and Food spoilage, second edition, An Aspen Publication Asoen Publishers, INC. Gaithersburg, Maryland.
17. Rahimi P. Rahimi, Sharifnabi, B. and Bahar, M. (2007), Detection of
Aflatoxin in Aspergillus species isolated from Pistachio in Iran, Department
of Plant Protection, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran, J.Phytopathology 156, 15–20 (2008) _ 2007 The Authors Journal compilation _ 2007 Blackwell Verlag, Berlin.
18. Rodrigues, P., Soares, C., Kozakiewicz, Z., Paterson, R.R.M., Lima, N., and Ven©ncio, A. (2007), Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating Current Research and Educational
Topics and Trends in Applied Microbiology, 527-534, A. Méndez-Vilas (Ed.), ©Formatex 2007.
19. Singh M., Sharma R., Banerjee U.C. (2002), Biotecnological applications
PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG Potatose dextrose agar (PDA)
Potato infusion 200 g Dextrose 20 g Agar 20 g Nước cất 1 liter pH 5,6 ± 0.2. Hấp khử trùng 15 phút, 121oC
Sabouraud agar (SAB)
Polypeptone or neopeptone 10 g
Dextrose 40 g
Nước cất 1 liter
pH 5,6 ± 0.2.
Hấp khử trùng 15 phút, 118-121oC
Yeast Extract Succrose agar (YES)
Proteose peptone 10 g Yeast extract 3,0 g NaCl 5,0 g Sucrose 20g Agar 15,0 g Nước cất 1 liter pH 7,2 ± 0.2. Hấp khử trùng 15 phút, 121oC
Dichloran 18% glycerol agar (DG18)
Glucose 10,0 g
Peptone 5,0 g
Potassium phosphate monobasic 1,0 g Magnesium sulfate heptahydrate 0,5 g Dichloran (0.2% in ethanol, w/v) 1,0 ml Agar 15,0 g Chloramphenicol 0,1 g Nước cất 800 ml Glycerol 220g
Thêm nước cất để cuối cùng đủ 1000ml pH 5,6 ± 0.2. Hấp khử trùng 15 phút, 121oC Czapekdox agar Sucrose 30,0 Sodium nitrate 3,0 Magnesium sulfate 0,5 Potassium chloride 0.5 g
Iron (III) sulfate 0,01
di-potassium hydrogen phosphate 1,0
Agar 13,0g
Nước cất 1000 ml
pH 7,3 ± 0.2.
Buterfield’s phosphate buffer
KH2PO4 34 g
Nước cất 500 ml
Chỉnh pH 7,2 bằng NaOH 1N, thêm nước cất đủ 1000ml
Hấp khử trùng 15 phút, 121oC, bảo quản trong tủ lạnh
Saline Peptone Water (SPW)
NaCl 8,5g
Peptone 1,0g
Nước cất 1000 ml
pH 7,0 ± 0.2.
PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT
Phát hiện Aspergillus flavus sinh Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang.
1. Phạm vi áp dụng:
Phương pháp này được dùng để định tính A. flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ
cốc .
2. Định nghĩa:
Nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin: là những khóm nấm mốc có đường kính d = 3 cm trên thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin sau 3 ngày, xung quanh khuẩn lạc phát huỳnh quang màu xanh lam. Khóm nấm lúc đầu hơi vàng, cuối cùng trở nên xanh lục hoặc vàng lục. Bơng lớn hình cầu, tỏa tia. Bọng hình cầu đến gần cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số lồi thể bình 2 tầng. Vách cuống đính bào tử xù xì. Hạt đính hình cầu đến gần cầu, có gai.
3. Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu xác định vào đĩa petri, đổ đĩa và ủ đĩa trong tối, ghi nhận khuẩn lạc đặc trưng trên thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin. Cấy chuyển riêng lẻ từng khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin để quan sát rõ hơn về việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc và để lấy mẫu làm tiêu bản quan sát sơ bộ hình thái nấm.
4. Mơi trường và thuốc thử:
Saline Peptone Water (SPW): Sabouraud agar (SAB)
Kháng sinh Chloramphenicol Methyl-β-cyclodextrin
5. Thiết bị Tủ ấm 28oC±1oC Bàn đọc UV (365nm) Kính hiển vi 6. Quy trình: 6.1 Chuẩn bị mẫu:
Cân 25 gam mẫu và thêm 225 ml dung dịch pha loãng SPW. Ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 10 phút. Đồng nhất mẫu 2 phút bằng máy dập mẫu. Thời gian thử nghiệm không quá 5 phút sau khi dập mẫu.
6.2. Đỗ đĩa:
Chuẩn bị các nồng độ pha lỗng thích hợp. Cấy 1 ml dịch mẫu pha loãng vào 2 đĩa petri vô trùng. Thêm 15 ml môi trường thạch SAB có bổ sung 0,3 methyl-β- cyclodextrin được làm nguội ở 45oC. Trộn đều mẫu bằng cách xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và chiều ngược lại. Để môi trường đơng lại.
6.3. Ủ đĩa:
Dùng giấy bạc gói kín đĩa, đặt ngữa đĩa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc và hạn chế làm khô thạch. Ủ các đĩa ở 28oC±1oC trong 3 ngày.
6.4. Đọc kết quả:
Chọn các đĩa có khuẩn lạc điển hình màu vàng hơi lục, đường kính 3cm, có vịng phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dưới đèn UV có bước sóng 365nm. Đồng thời lấy mẫu làm tiêu bản để quan sát sơ bộ hình thái của nấm mốc như cuống đính bào tử, bào tử, bọng, thể bình… Nếu nấm mốc mọc dày đặc trên đĩa, khó quan sát, có thể cấy các khuẩn lạc nghi ngờ (có màu vàng lục) sang đĩa thạch SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin khác để quan sát rõ hơn.
Kết quả được ghi nhận: phát hiện hoặc không phát hiện nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin trên 25 g mẫu.