CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Phương pháp phát hiện A flavus
1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]:
Việc phát hiện nấm mốc A. flavus thường dựa vào đặc điểm hình thái. Nếu phân loại đến giống thì rất dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử, nhưng để phân biệt đến lồi thì rất phức tạp, thường dựa vào các đặc điểm sau:
+ Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử và sợi nấm, đường kính khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc thay đổi, sự tạo sắc tố của các giọt tiết.
+ Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào sự sắp xếp, hình dạng và kích thước của bọng, bào tử và hình thái cuống, sự hiện diện tế bào Hülle, và hình thái của nang bào tử. Hơn nữa, tất cả các đặc điểm hình thái phải được xác định trong điều kiện phịng thí nghiệm chuẩn được thực hiện bởi các chun gia phân tích nấm để có thể nhận diện chính xác.
Thơng thường, người ta thường dựa vào một số môi trường nuôi cấy chọn lọc cho nấm như Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc hoặc sử dụng một số mơi trường khác như: để nhận diện nhóm
A. flavus dựa trên đặc tính chuyển hóa màu mơi trường ở mặt sau đĩa thạch sang vàng cam đối với môi trường Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar
(AFPA) và Coconut cream agar (CCA) dùng để phát hiện những chủng sinh
Aflatoxin, sự tạo Aflatoxin được phát hiện bằng cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam dưới đèn UV.
Hình 1.5. (a) A. flavus trên mơi trường AFPA (Aspergillus flavus and Aspergilus
parasiticus agar), sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau
môi trường thành màu cam.
(b) A. flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA (Coconut cream agar) nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A. flavus
1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]:
Phương pháp sinh học phân tử được áp dụng rộng rãi để nhận diện các loài
A. flavus. Phần lớn thường sử dụng trình tự DNA mục tiêu là một trong những phức
rDNA, thường là vùng ITS1 and ITS2 bên trong vùng phiên mã và vùng thay đổi ở đầu 5’ vùng D1-D2 của 28S rRNA.
Tuy nhiên, các lồi thuộc nhóm A. flavus rất khó phân biệt dựa vào trình tự
gen. Các lồi A. flavus, A. parasiticus, A. oryzae and A. sojae có trình tự tương đồng cao và kích thước cũng tương tự nhau, trình tự DNA của chúng tương đồng từ 91 đếm 100%. Nhưng, kỹ thuật phân tích Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) có thể phân biệt được 2 lồi A. parasiticus and A. sojae.
Do đó, để nghiên cứu A. flavus, hoặc để so sánh A. flavus với các loài
nhiều vùng phức hợp rDNA và các gen liên quan đến quá trình sản sinh Aflatoxin đã được thử nghiệm dùng làm markers với những mức độ thành công khác nhau. Một số nghiên cứu dựa trên kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng để phân tích sự khác biệt trên trình tự được khuếch đại. Nhưng sự khuếch đại trình tự mục tiêu của PCR phải được thực hiện thêm bằng kỹ thuật Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms (SSCP) thì mới dễ dàng phân biệt A. flavus với các loài khác dựa trên đoạn 600bp
tương ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4. Một số tác giả cho rằng khi sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP có thể loại bỏ được khó khăn lớn khi có sự thay đổi về mặt chủng loại. Tuy nhiên, những phân tích này khơng phân biệt được những chủng có sinh Aflatoxin và khơng sinh Aflatoxin. Chang và cộng sự (1995) đã tìm thấy gen aflR để có thể nhận biết chủng A. flavus và A. parasiticus, nhưng Somashekar và cơng sự (2004) có thể phân biệt được riêng biệt 2 chủng A. flavus và A. parasiticus dựa trên kỹ thuật RFLP
bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII. Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi để nhận diện vùng mục tiêu là bước tiến nhằm phân biệt các lồi này và đã thành cơng khi sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes. Nhưng phương pháp này không phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin. Để phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin phải sử dụng phương pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem sự biểu hiện của gen sản sinh Aflatoxin dựa vào các gen liên quan đến q trình điều hịa và gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Scherm và cộng sự (2005) đã nghiên cứu trên 13 chủng ở cả 2 loài A. flavus và A. parasiticus và tìm thấy 3 gen (aflD, aflO [syn. dmtA=omtB] and aflP [syn. omtA]) có thể sử dụng để phát hiện khả năng sinh Aflatoxin và được sử dụng làm marker để nhận diện chúng.
Do đó, thật khó để phân biệt được chủng A. flavus với các loài tương tự như
A. nomius and A. parasiticus. Người ta thường phải kết hợp nhiều phương pháp
khác nhau mới có thể nhận diện và phân biệt chính xác các lồi có khả năng sinh Aflatoxin.