CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14]
Thí nghiệm này xác định 4 thuộc tính: độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả.
Thí nghiệm được thực hiện lặp lại với 01 chủng A. flavus có sinh độc tố
nền mẫu thức ăn có cấu trúc dạng hạt. Các mẫu được chọn đã được kiểm tra và khẳng định là không nhiễm A. flavus.
Cách thực hiện:
Chuẩn bị mẫu: lấy 25 g mẫu, pha loãng với 225 g SPW. Dập mẫu 1- 2 phút, tốc độ 200 vòng/phút.
Chuẩn bị chủng: 01 chủng A. flavus có sinh độc tố Aflatoxin B1 và 1 chủng A. flavus không sinh độc tố Aflatoxin B1 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28oC trong 7 ngày cho đến khi bào tử được tạo ra và được chuẩn bị sẵn dịch huyền phù bào tử.
Gây nhiễm mẫu: mỗi mẫu được gây nhiễm với 2 chủng, 1 là chủng nấm mốc
mục tiêu và 1 không phải chủng nấm mốc mục tiêu bằng cách lấy 1ml dịch huyền phù bào tử A. flavus có sinh độc tố Aflatoxin B1 và 1ml chủng A. flavus không sinh
độc tố Aflatoin B1 vào dịch mẫu. Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở nhiều nồng độ khác nhau và gây nhiễm mẫu ngẫu nhiên sao cho có ít nhất 30 mẫu âm và 30 mẫu dương. Đồng nhất lại mẫu và pha loãng dịch mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
Cấy mẫu: Từ các dịch mẫu pha loãng ở nhiều nồng độ, cấy 1ml vào đĩa các
đĩa petri vô trùng. Cấy lặp lại 5 lần cho mỗi độ pha lỗng. Đổ đĩa với thạch SAB có bổ sung methyl-β-cyclodextrin. Gói ủ các đĩa trong giấy sạch ở 28oC, 3 ngày.
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng: Phân biệt các khuẩn lạc có phát huỳnh quang và
các khuẩn lạc không phát huỳnh quang tương ứng với các chủng A. flavus sinh
Aflatoxin B1và không sinh Aflatoxin B1.
Thẩm tra các mẫu cấy có sự hiện diện A. flavus : phân tích mẫu theo quy trình
phân tích của FAO (1992)
Thẩm tra khả năng sinh aflatoxin B1 của các chủng bằng phương pháp HPLC:
Cấy chuyển riêng lẻ các khuẩn lạc phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang lên mơi trường SAB có bổ sung methyl cyclodextrin nuôi ủ 3 ngày. Tách chiết mẫu và kiểm tra Aflatoxin B1 bằng HPLC.
Sau khi thẩm tra, kết quả được chia làm 4 nhóm:
a: số khuẩn lạc dương tính giả định (điển hình) được khẳng định là dương (dương tính thực).
b: số khuẩn lạc âm tính giả định (khơng điển hình) được khẳng định là dương (âm tính giả).
c: số khuẩn lạc dương tính giả định được khẳng định là âm (dương tính giả). d: số khuẩn lạc âm tính giả định được khẳng định là âm (âm tính thực). Sắp xếp tần suất 4 nhóm trên theo như Bảng 2.2. sau:
Bảng 2.2. Cách sắp xếp tần suất 4 nhóm kết quả:
Số đếm giả định Mẫu khảo sát Dương tính
(điển hình) Âm tính (khơng điển hình) Tổng số Khẳng định là dương a b a+b Khẳng định là âm c d c+d Tổng số mẫu a+c b+d n Cơng thức tính các thơng số: Độ nhạy = a/(a+b) Độ đặc hiệu = d/(c+d)
Tỷ lệ dương tính giả = c/(a+c) Tỷ lệ âm tính giả = b/(b+d).