CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14]
Thí nghiệm khảo sát trên 3 chủng A. flavus có sinh Aflatoxin B1. Hai loại
nền mẫu được chọn là thức ăn chăn nuôi dạng bột và thức ăn chăn nuôi dạng hạt. Các mẫu này đã được kiểm tra trước bằng quy trình phân tích nấm mốc A. flavus của FAO (1992) và khẳng định là không nhiễm A. flavus.
Chuẩn bị mẫu: cân một loạt (20 mẫu), mỗi mẫu 25 g vào các túi PE vô trùng.
Mỗi mẫu được pha loãng với 225 g dịch pha loãng SPW. Để yên mẫu trong 5 phút, dập mẫu 1-2 phút ở tốc độ 200 vòng/phút.
Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử nấm mốc A. flavus: dịch huyền phù bào tử
nấm mốc A. flavus đã xác định được mật độ bằng phương pháp đếm đĩa trước đó. Pha lỗng dịch huyền phù bào tử nấm mốc ở các độ pha lỗng thích hợp (1/10, 1/5, 1/2,..) để đạt được các mật độ 10, 20, 30, …, 150, 200 cfu/ml.
Gây nhiễm mẫu: Cấy 1 ml dịch huyền phù ở các độ pha loãng khác nhau vào
25g mẫu đã pha loãng. Cấy đồng thời 1ml dịch pha lỗng vào các đĩa petri vơ trùng để kiểm tra lại mật độ bào tử A. flavus gây nhiễm. Đồng nhất mẫu với dịch huyền phù 30 giây.
Cấy mẫu: cấy 1 ml dịch mẫu đã gây nhiễm ở các mật độ bào tử khác nhau vào đĩa petri vô trùng. Mỗi mẫu cấy lặp lại 6 đĩa. Đổ đĩa với thạch SAB có bổ sung methyl-β-cyclodextrin. Ủ các đĩa trong điều kiện tối ưu đã khảo sát trên.
Đọc và ghi nhận kết quả: Đếm số đĩa có khuẩn lạc trong số 6 đĩa cấy từ cùng
một mẫu và ghi nhận kết quả dưới dạng n/6 (n: số đĩa có khuẩn lạc). Chọn ra mức 3 mật độ gây nhiễm vào mẫu (ngưỡng gây nhiễm dưới, giữa và trên) sao cho tỷ lệ phát hiện tương ứng với 3 ngưỡng đạt 1/6, 2/6 hoặc 3/6, 5/6 hoặc 6/6.
Tính giới hạn phát hiện của phương pháp:
LC = 1,65 x S0 (cfu/ khối lượng hoặc thể tích mẫu thử) S0 (threshold hay estimate of spread) là giá trị ngưỡng. Giới hạn phát hiện: LOD(cfu/g) = (3,3 x S0)/m
m : khối lượng mẫu thử nghiệm (mẫu rắn).
25g mẫu + 225g SPW Dập mẫu
Gây nhiễm A. flavus a1 cfu a2 cfu a3 cfu Phân bố đều
Cấy 1ml vào đĩa, 1 mẫu 6 lần Ủ đĩa
Đếm số đĩa có khuẩn lạc n/6 n’/6 n’’/6
ở mỗi dãy cấy
Giá trị tới hạn ước lượng (LC = a2) Ỉ Giới hạn phát hiện.
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp