Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.6.2 Khảo sát sơ bộ độc tính cytotoxic trên bào xác Artemia
Artemia salina đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ như một sinh vật thử nghiệm
trong nghiên cứu sản phẩm tự nhiên và để đánh giá tác dụng của hóa chất trong mơi trường nước [39, 40, 55]. Thử nghiệm Artemia được sử dụng thường xuyên trong các
phịng thí nghiệm trên khắp thế giới để sàng lọc các chất chiết xuất từ thực vật với các đặc tính dược liệu tiềm tàng (ví dụ, kháng khuẩn hoặc chống nhiễm trùng), để phân tách thành phần hoạt tính sinh học của chiết xuất thực vật và phát hiện tác dụng gây độc tế bào [1, 3, 8, 11, 15, 18, 41, 58, 60, 78].
Lý do chính tại sao lồi giáp xác Artemia salina nước mặn này được sử dụng rộng rãi để kiểm tra độc tính của chiết xuất thực vật là do sự sẵn có thương mại của trứng
Artemia, được thu hoạch với số lượng lớn trong hồ nước mặn. Chúng được sử dụng nhiều
trên toàn thế giới trong nuôi trồng thủy sản như làm thức ăn sống cho cá con. Do đó trứng Artemia là nguồn sinh học thích hợp cho thực hiện nghiên cứu nhanh chóng, đơn giản và rẻ tiền.
Artemia salina là một chi động vật giáp xác thủy sinh có kích thước khoảng 1 mm.
Trứng của chúng được bảo quản ở dạng đông khô và dễ dàng mua được ở các cửa hàng cá cảnh. Chúng sinh sống ở các hồ nước mặn trong lục địa trên khắp thế giới, trừ các đại dương. Chúng có khả năng tránh sống chung với các lồi săn mồi như cá, bằng khả năng sinh sống ở các vùng nước có độ mặn cao (lên đến 25%). Khả năng cytotoxic gây độc tế bào được xác định bằng phương pháp khảo sát khả năng gây độc trên loài bào xác
Artemia được mô tả dựa theo Meyer và cộng sự (1982). Potassium dichromate được
dùng làm chất chuẩn [39].
Nguyên tắc: xây dựng phương trình đường chuẩn giữa nồng độ chế phẩm với tỉ
lệ chết: y= ax+b.
Bước 1: Trứng Artemia được ủ trong một bình chứa nước biển nhân tạo vơ trùng
được sản xuất bằng cách hòa tan 38 g muối ăn trong 1 L nước cất ở nhiệt độ 28 – 30oC sục khí tốt (sử dụng bơm khơng khí), dưới điều kiện ánh sáng liên tục (60W) trong 48h. Sau khi trứng nở, những con Artemia được hút bằng pipet Pasteur vào các giếng (mỗi giếng 10 con) đã được chuẩn bị sẳn 5mL nước biển.
Bước 2: Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức.
Mẫu đối chứng dương (DC) ta hút 1mL nước biển cho vào giếng có Artemia. Mẫu đối chứng âm (T) dùng Potassium dichromate làm chất chuẩn được pha loãng ở các nồng độ (1000, 500, 250, 125 µg/mL). Hịa tan 5mg mẫu thực nghiệm trong 1mL DMSO. Những mẫu thử (M) sẽ được pha loãng thành các nồng độ khác nhau (1000, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 µg/mL) với nước biển. Sau đó cho hút 1mL mẫu thử vào từng giếng đã có Artemia chuẩn bị trước đó. Sau 24h đếm số con còn sống trong mỗi
giếng. Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm Mẫu Nồng độ (µg/mL) Giếng (10 con A.Salina) TN DC 5mL 1mL nước biển T1 1000 5mL 1mL K2Cr2O7 T2 500 5mL 1mL K2Cr2O7 T3 250 5mL 1mL K2Cr2O7 T4 125 5mL 1mL K2Cr2O7 M1 1000 5mL 1mL mẫu M2 800 5mL 1mL mẫu M3 400 5mL 1mL mẫu
M4 200 5mL 1mL mẫu M5 100 5mL 1mL mẫu M6 50 5mL 1mL mẫu M7 25 5mL 1mL mẫu M8 12,5 5mL 1mL mẫu M9 6,25 5mL 1mL mẫu
Bước 3: Tính tốn % gây chết Artemia với mỗi nồng độ tương ứng và đối chứng.
Vẽ đồ thị biểu hiện sự tương quan và giá trị LC50. Đánh giá khả năng gây độc cytotoxic trên Artemia dựa vào chỉ số LC50, đây là chỉ số cho biết nồng độ của mẫu mà tại đó nó gây chết 50% số lượng bào xác.
Tại mỗi nồng độ: số con chết =10 – số con sống Số con chết thí nghiệm trung bình
SCCTNTB= số con chết ở mẫu 1+số con chết ở mẫu 2+ số con chết ở mẫu 3 3
Số con chết do chế phẩm = SCCTNTB - Số con chết ở ống đối chứng dương Tỉ lệ tử vong = số con chết do chế phẩm
30 x 100
Bảng 2.3 Tính tốn kết quả chất chuẩn Nồng độ
K2Cr2O7 Log10[nồng độ] % tử vong Bảng giá trị probit
1000 X1 B1 Y1
500 X2 B2 Y2
250 X3 B3 Y3
Bảng 2.4 Tính tốn kết quả mẫu thí nghiệm
Nồng độ mẫu Log10[nồng độ] % tử vong Bảng giá trị probit
1000 X1 B1 Y1 800 X2 B2 Y2 400 X3 B3 Y3 200 X4 B4 Y4 100 X5 B5 Y5 50 X6 B6 Y6 25 X7 B7 Y7 12,5 X8 B8 Y8 6,25 X9 B9 Y9
Từ bảng trên, lập được phương trình đường chuẩn giữa Y và X: y= ax + b (*) Tra bảng probit LC50 thế vào y của pt (*) tính được giá trị x