Theo tài liệu của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, trong nghiên cứu khả năng chống tăng sinh tế bào Ung thư của dược liệu, những cao tổng của dược liệu cho kết quả IC50 dưới 50 g/ml chứng tỏ dược liệu này có khả năng kháng tế bào ung thư khá mạnh [24]. Cao cồn của Nhân trần tía đã cho kết quả khá ổn với giá trị IC50 trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 là 38,15 ± 0,61 µg/mL và ung thư phổi A549 là 13,1 ± 1,12 µg/mL kém lần
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Cao cồn Camptothecin 38,15 ± 0,61 13,18 ± 0,14 IC5 0 µ g /m l 0 2 4 6 8 10 12 14 Cao cồn Camptothecin 13,1 ± 1,12 3,94 ± 0,2 IC5 0 µ g /m l
lượt 2,8 lần và 3,3 lần so với đối chứng thuốc chống ung thư camptothecin được thử nghiệm ở cùng nồng độ. Trước đó, trong nghiên cứu của Nguyen Ngoc Hong và đồng cộng sự cũng đã cho thấy rằng cao cồn nhân trần tía cũng thể hiện hoạt tính gây độc khá tốt trên dòng tế bào ung thư phổi khác là NCI-H460 với IC50 = 30,31 ± 1,60 μg/mL và ở kết quả nghiên cứu này cao cồn nhân trần tía cũng thể hiện hoạt tính tương tự trên dịng tế bào ung thư phổi khác là A549, được biết dòng tế bào A549 mạnh hơn dòng tế bào NCI-H460 [68]. Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2010) đã khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư của Nhân trần nam Adenosma caeruleum, so sánh với kết quả với nhóm nghiên cứu này cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum đã cho kết quả tương đương về khả
năng ức chế trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 [66]. Trong một nghiên cứu của Thiard Franck và cộng sự vào năm 2008, nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát 30 cao chiết từ 19 loài cây thường dùng trong dân gian miền Nam Việt Nam để chữa u nhọt, ung thư thì chỉ có 7 cao thể hiện hoạt tính; một nghiên cứu khác với 31 dược liệu dùng chữa bệnh ung thư ở miền Bắc Việt Nam của Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2010) chỉ thu được kết quả khả quan trên 9 loài [83, 66]. Việc phát hiện ra một dược liệu có khả năng kháng ung thư là khơng đơn giản, đề tài này đã góp phần bổ sung thêm một nguồn thông tin quý giá để làm nền tảng nghiên cứu sâu hơn về thành phần và cơ chế kháng ung thư của Nhân trần tía.
3.4 Khảo sát sơ bộ độc tính cytotoxic trên bào xác Artemia
Phương pháp này có liên quan đáng kể đến việc ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư ở người được chứng minh bởi Viện Ung thư Quốc gia (NCI, Hoa Kì) và cho thấy giá trị của phương pháp này như một công cụ sàng lọc trước khi đưa vào nghiêm cứu thuốc chống ung thư [3]. Thử nghiệm này cũng có tương quan khá tốt với hoạt tính gây độc tế bào và có thể được sử dụng để khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học [6].
Hình 3.3 Tỉ lệ chết Artemia của các cao chiết và cao phân đoạn
từ Nhân trần tía sau 24h
Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của các cao chiết.
Cao chiết LC50 (µg/mL)
Cao cồn 647,64
Cao nước >1000
Cao phân đoạn HE 210,73
Cao phân đoạn Ethylacetate >1000
Cao phân đoạn n-butanol >1000
Potassium Dichromate (chứng dương) 27,75
Như thể hiện trong hình 3.3, độc tính tế bào chứng tỏ mối quan hệ giữa nồng độ của các mẫu và mức độ gây độc tế bào, từ đó cho biết các mẫu nào có hoạt tính sinh học. Từ bảng 3.3 cho thấy giá trị LC50 của cao chiết cồn sau 24h là 647,64 µg/mL, có thể
0 20 40 60 80 100 120 6 . 2 5 1 2 . 5 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 1 0 0 0 T ỷ lệ c h ết (% ) Nồng độ mẫu (µg/mL)
Potassium Dichromate Cao cồn
Cao nước Cao phân đoạn HE
chứng tỏ rằng cao cồn có hoạt tính gây độc khá mạnh đối với Artemia (LC50 < 1,0 mg/mL) [39]. Các cao phân đoạn của cao chiết cồn trong đó có cao phân đoạn HE thể hiện hoạt tính tốt nhất với LC50 là 210,73 µg/mL. Các cao phân khác như ethyacetate, n- butanol, cao nước có LC50 > 1000 µg/mL được coi là khơng có hoạt tính. Như vậy có thể thấy cao phân đoạn HE có tiềm năng phân lập được hợp chất tự nhiên có khả năng chống tế bào ung thư.
3.5 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao phân đoạn HE 3.5.1 Phân lập 3.5.1 Phân lập
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả sắc ký cột cao HE thu được 6 phân đoạn. Các phân đoạn được đánh giá bằng sắc ký bản mỏng trong nhiều hệ dung môi khác nhau để tiến hành sắc ký cột thu nhận hợp chất tinh khiết.
Bảng 3.4 Các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột
Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi rửa giải Khối lượng
HE1 1 2H:1EA 1,78g HE2 2 2H:1EA 1,51g HE3 3-4 2H:1EA 2,46g HE4 5-10 2H:1EA 1,82g HE5 11-14 2H:1EA 2,58g HE6 15-18 2H:1EA 1,72g
Hình 3.4 Bảng sắc ký của cao HE sau khi giải ly ở hệ dung môi H:Ea (1:1)
Từ 6 phân đoạn thu được sau khi rửa giải cao HE trong hệ dung môi 2H:1EA, nhận thấy phân đoạn HE5 có khối lượng nhiều nhất và cho các vết rõ đẹp sau khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng nên chọn phân đoạn HE5 để tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trong hệ dung môi 7H:3EA.
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả thu được từ HE5 cho ra thêm 4 phân đoạn khác từ A5.1 đến A5.4. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, nhận thấy phân đoạn A5.4 chứa 2 vết chính rõ đẹp nên được khảo sát trước, các phân đoạn còn lại được nghiên cứu sau.
Sau khi kết thúc rửa giải kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng. Hợp chất thu được được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng ở nhiều hệ dung môi khác nhau nhằm đảm bảo độ tinh khiết
Phân đoạn A5.4 được sắc ký cột nhiều lần bằng hệ dung mơi 1H:4C thì thu được hợp chất HA1, HA2. Hợp chất HA1 được kiểm tra qua nhiều hệ dung môi để đánh giá độ tinh khiết. Hợp chất HA1 có những đặc điểm sau:
• Hợp chất có màu vàng, kết tinh hình kim.
• Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly 1H:4C cho một vết với Rf = 0,73, tiếp tục thay đổi hệ giải ly 3H:1Ea thu được 1 vết tròn, rõ với Rf = 0,34, chứng tỏ đây là chất sạch.
Cho giải ly hấp thu UV 254m, tiếp theo nhúng với thuốc thử 5% vanillin/ EtOH và sau khi sấy ở nhiệt độ 700C cho một vết màu vàng duy nhất. Nghi ngờ là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.5 Hợp chất HA1 sau khi được giải ly trong hệ dung môi
1H:4C (A) và 3H:1Ea (B)