Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.6.1 Phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase
Đái tháo đường là một nhóm các bệnh lý chuyển hóa đặc trưng bởi tăng glucose trong máu do khiếm khuyết tiết insuline, khiếm khuyết hoạt động insuline, hoặc cả hai. Tăng glucose máu mãn tính trong đái tháo đường sẽ gây tổn thương, rối loạn chức năng hay suy nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu. Do đó việc làm giảm nồng độ đường trong máu là vấn đề cần quan tâm.
Cơ chế hoạt động ức chế enzyme α - glucosidase ở ruột:
Cụ thể chất ức chế α -glucosidase hoạt động như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzyme cần thiết để tiêu hóa carbohydrate: đặc biệt enzyme α -glucosidase trong đường tế bào viền của ruột non. Các chất ức chế α-glucosidase ruột kết hợp màng tế bào để thủy phân các carbohydrate phức tạp như oligosaccharides, trisaccharides, disaccharides đến glucose và các monosaccharides khác trong ruột non. Các carbohydrate phức tạp bao gồm bánh mì, ngũ cốc, mì ống, gạo, bột, đậu, khoai tây, ngơ. Ức chế các hệ enzym này làm giảm tỷ lệ tiêu hóa carbohydrate. Vì vậy nồng độ glucose trong máu sẽ giảm vì các carbohydrate khơng bị thủy phân thành các phân tử glucose [50].
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase dựa trên phương pháp phân tích trắc quang. Enzyme α-glucosidase xúc tác quá trình thủy phân cơ chất heterogenous như saccharose và p-nitrophenyl-α-ᴅglucopyranoside. Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase, p-nitrophenyl-α-ᴅ-glucopyranosid (p-NP-G) được sử dụng như là cơ chất ban đầu (chất nền) và enzyme α-glucosidase sẽ chuyển hóa cơ chất này thành α-ᴅ- glucose và p-nitrophenol. Theo phản ứng, lượng α-ᴅ-glucose sinh ra tỉ lệ với p-NP-G bị thủy phân và lượng p-nitrophenol tạo thành. Vì vậy dựa vào độ hấp thu của p- nitrophenolate ở bước sóng 405 nm có thể định lượng α-ᴅ-glucose sinh ra. Khi mẫu thử có hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase thì hàm lượng p-nitrophenol tạo thành sẽ giảm. So sánh cường độ màu của dung dịch khi có và khơng có hoạt chất ức chế, sẽ tính được khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất đó [84].
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng tôi sử dụng acarbose làm chất đối chứng dương để so sánh, vì đây là hợp chất được sử dụng làm chất đối chứng trong các tài liệu tham khảo.
Hình 2.2 Phản ứng thủy phân enzyme α-glucosidase với cơ chất
p-nitrophenyl-α-ᴅ-glucopyranoside
Hình 2.3 Cấu trúc của acarbose (C25H43NO18)
Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa theo phương pháp tiêu chuẩn của Nishioka et al. (1998), Bhandari et al. (2008), Gao et al. (2008) với sửa đổi nhỏ [13, 22, 46].
Trong một đĩa 96 giếng, hỗn hợp phản ứng chứa 50 μl phosphate đệm (0,1 mM, pH = 6,9), 10 μl α -glucosidase (0,1 U/ml) và 20 μl nồng độ dịch chiết và phân số khác
nhau (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mg/ml) đã được xác định trước ở 37°C trong 10 phút. Sau đó, 20 μl P-NPG (5 mM) đã được thêm vào dưới dạng chất nền và được ủ tiếp ở 37°C trong 20 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 100 μl Na2CO3 (0,1 M). Độ hấp thụ của p-nitrophenol được giải phóng được đo ở 405nm bằng cách sử dụng Multiplate Reader. Acarbose ở các nồng độ khác nhau (0,1-0,5 mg/l) được đưa vào làm chất chuẩn.
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm
Nồng độ mẫu (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Đệm phosphate 0.1mM (pH=6.9)
50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl
Enzyme α-glucosidase 0,1 U/ml 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl
Mẫu thử 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl Ủ 37oC, 10phút P-NPG (5 mM) 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl Ủ 37oC, 20phút Na2CO3 (0.1 M) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Dừng phản ứng
Tất cả các mẫu đều được phân tích lập lại 3 lần, bao gồm cả giá trị IC50. Các kết quả được biểu thị bằng phần trăm ức chế, được tính bằng cơng thức:
Inhibition(%) = [(Acontrol-Asample)]/ Acontrol] x100 Trong đó:
Asample: độ hấp phụ của mẫu
Acontrol: độ hấp phụ của đối chứng âm
Dựa trên phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau của mẫu thử, tiến hành đánh giá khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của mẫu thử thông qua giá trị IC50.
Giá trị IC50 (Inhibitory concentration) được định nghĩa là nồng độ của một mẫu thử mà tại đó nó có thể ức chế được 50 % enzyme α-glucosidase.