Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.4 Phương pháp chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết
Mẫu cao chiết thu được từ cây tuyến hương lá bắc là hỗn hợp nhiều tạp chất hữu cơ. Việc tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp được thực hiện trên cột silicagel với các hệ dung mơi thích hợp. Quy trình phân lập hợp chất trên cột silica gel thường được lặp lại một vài lần để thu được chúng ở dạng tinh sạch, đáp ứng yêu cầu xác định cấu trúc hóa học. Trong đề tài này, tiến hành phân lập hoạt chất từ mẫu cao bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển
a. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng điện tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
b) Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (105875, Merck), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10% pha trong cồn 90o, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất,
sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung mơi thích hợp.
c) Sắc ký cột (Chromatography Column)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel thường với kích thước hạt 0,040 – 0,063 mm (240 – 430 mesh); pha đảo sử dụng loại YMC có cỡ hạt là 30 – 50 µm (Fujisilica Chemical Ltd.); nhựa trao đổi ion sử dụng loại Diaion HP – 20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).
Chi tiết quá trình thu nhận hợp chất tính khiết được mơ tả như sau:
Sơ đồ 2.2 Quy trình thu nhận hợp chất tinh khiết trên cao HE
Chuẩn bị mẫu: Mẫu cao HE đặc được hịa tan bằng các dung mơi thích hợp. Tiến
hành nhồi silica gel Merck loại hạt 0,040 – 0,063 mm, lượng silica gel khô thêm vào dung dịch gấp 10 lần khối lượng mẫu ban đầu. Lắc, khuấy nhẹ để đảm bảo silica gel hấp phụ các chất có trong dung dịch. Tiến hành sấy đến khi thấy silica gel khô và tơi.
Chọn hệ: các hệ dung môi đươc chọn dựa trên khả năng tách các vết trên sắc ký
bản mỏng. Hệ dung môi được sử dụng cho sắc ký cột cao HE là 2H:1EA
Nhồi cột:
Lọc tách dịch chiết
HE6A và tủa HE6B
HE1 HE2 HE3 HE4 HE5 HE6
2H:1Ea
Cao phân đoạn Cao HE
HE6A HE6B HA3 1H:4C 7H:3Ea A5.4 A5.3 A5.2 A5.1 HA1 HA2
+ Chọn cột có kích thước 60 x 5cm (chiều dài cột x đường kính cột). + Pha tĩnh là silica gel Merck loại hạt 0,040-0,063mm.
+ Pha động rửa giải bằng dung mơi có độ phân cực tăng dần từ 2H:1EA +Dung dịch rửa giải qua cột được hứng trong các erlen với thể tích 250mL mỗi lần hứng.
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả sắc ký cột cao HE thu được 6 phân đoạn. Các phân đoạn được đánh giá bằng sắc ký bản mỏng trong nhiều hệ dung môi khác nhau để tiến hành sắc ký cột thu nhận hợp chất tinh khiết.
Từ 6 phân đoạn thu được sau khi rửa giải cao HE trong hệ dung môi 2H:1EA, nhận thấy phân đoạn HE5 có khối lượng nhiều nhất và cho các vết rõ đẹp sau khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng nên chọn phân đoạn HE5 để tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trong hệ dung môi 7H:3EA.
Chuẩn bị mẫu: mẫu cao phân đoạn HE5 được tiến hành hòa tan bằng dung
mơi cho đến khi tan hồn tồn. Tiến hành nhồi silica gel Merck loại hạt 0,040 – 0,063 mm, lượng silica gel khô thêm vào dung dịch gấp 10 lần khối lượng mẫu ban đầu. Lắc, khuấy nhẹ để đảm bảo silica gel hấp phụ các chất có trong dung dịch. Tiến hành sấy đến khi thấy silica gel khô và tơi.
Chọn hệ: phân đoạn HE5 sau khi chấm sắc ký bản mỏng cho nhiều vết rõ
và đẹp trong hệ dung môi 7H:3EA
Nhồi cột:
+ Chọn cột có kích thước 40 x 2,5 cm (chiều dài cột x đường kính cột). + Pha tĩnh là silica gel Merck loại hạt 0,040-0,063mm.
+ Pha động rửa giải bằng dung môi 7H:3EA
+ Dung dịch rửa giải qua cột được hứng trong các hủ bi với thể tích 30 ml mỗi lần hứng.
Kết quả thu được từ HE5 cho ra thêm 4 phân đoạn khác từ A5.1 đến A5.4. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, nhận thấy phân đoạn A5.4 chứa 2 vết chính rõ đẹp nên được khảo sát trước, các phân đoạn còn lại được nghiên cứu sau.
Chọn phân đoạn A5.4 sắc ký cột silica gel pha thường để thu hợp chất tinh khiết.
Chuẩn bị mẫu: Mẫu cao A5.4 đặc được hịa tan bằng các dung mơi thích
hợp. Tiến hành nhồi silica gel Merck loại hạt 0,040 – 0,063 mm, lượng silica gel khô thêm vào dung dịch gấp 10 lần khối lượng mẫu ban đầu. Lắc, khuấy nhẹ để đảm bảo silica gel hấp phụ các chất có trong dung dịch. Tiến hành sấy đến khi thấy silica gel khô và tơi.
Chọn hệ: các hệ dung môi được chọn dựa trên khả năng tách các vết trên
sắc ký bản mỏng. Hệ dung môi được sử dụng cho sắc ký cột cao HE là 1H:4C.
Nhồi cột:
+ Chọn cột có kích thước 30 x 2 cm (chiều dài cột x đường kính cột). + Pha tĩnh là silica gel Merck loại hạt 0,040-0,063mm
+ Pha động rửa giải bằng hệ dung mơi có độ phân cực trung bình 1H:4C + Dung dịch rửa giải qua cột được hứng trong các hủ bi với thể tích 1-5 mL mỗi lần hứng
Sau khi kết thúc rửa giải kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng. Hợp chất thu được được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng ở nhiều hệ dung môi khác nhau nhằm đảm bảo độ tinh khiết
Phân đoạn A5.4 được sắc ký cột nhiều lần bằng hệ dung mơi 1H:4C thì thu được hợp chất HA1, HA2.
Quan sát phân đoạn HE6 thấy xuất hiện kết tủa, tiến hành hịa tan bằng các dung mơi sau n-hexan, ethyl acetat, chloroform, acetone nhận thấy kết tủa chỉ tan trong
acetone. Cho bay hơi dung mơi hồn tồn, tiến hành rửa tủa, sử dụng các dung môi khác acetone. Lọc tách dịch chiết HE6A và kết tủa HE6B. Quá trình này được lặp đi lặp lại
nhiều cho tới khi tủa sạch hoàn toàn, thu được hợp chất tinh khiết. Tủa HE6B sau khi rửa liên tục thu được hợp chất đặt tên HA3.