Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi rửa giải Khối lượng
HE1 1 2H:1EA 1,78g HE2 2 2H:1EA 1,51g HE3 3-4 2H:1EA 2,46g HE4 5-10 2H:1EA 1,82g HE5 11-14 2H:1EA 2,58g HE6 15-18 2H:1EA 1,72g
Hình 3.4 Bảng sắc ký của cao HE sau khi giải ly ở hệ dung môi H:Ea (1:1)
Từ 6 phân đoạn thu được sau khi rửa giải cao HE trong hệ dung môi 2H:1EA, nhận thấy phân đoạn HE5 có khối lượng nhiều nhất và cho các vết rõ đẹp sau khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng nên chọn phân đoạn HE5 để tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trong hệ dung môi 7H:3EA.
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả thu được từ HE5 cho ra thêm 4 phân đoạn khác từ A5.1 đến A5.4. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, nhận thấy phân đoạn A5.4 chứa 2 vết chính rõ đẹp nên được khảo sát trước, các phân đoạn còn lại được nghiên cứu sau.
Sau khi kết thúc rửa giải kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng. Hợp chất thu được được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng ở nhiều hệ dung môi khác nhau nhằm đảm bảo độ tinh khiết
Phân đoạn A5.4 được sắc ký cột nhiều lần bằng hệ dung mơi 1H:4C thì thu được hợp chất HA1, HA2. Hợp chất HA1 được kiểm tra qua nhiều hệ dung môi để đánh giá độ tinh khiết. Hợp chất HA1 có những đặc điểm sau:
• Hợp chất có màu vàng, kết tinh hình kim.
• Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly 1H:4C cho một vết với Rf = 0,73, tiếp tục thay đổi hệ giải ly 3H:1Ea thu được 1 vết tròn, rõ với Rf = 0,34, chứng tỏ đây là chất sạch.
Cho giải ly hấp thu UV 254m, tiếp theo nhúng với thuốc thử 5% vanillin/ EtOH và sau khi sấy ở nhiệt độ 700C cho một vết màu vàng duy nhất. Nghi ngờ là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.5 Hợp chất HA1 sau khi được giải ly trong hệ dung môi
1H:4C (A) và 3H:1Ea (B)
Hình 3.6 Hợp chất HA1
Hợp chất HA2 là chất có màu vàng, tan trong acetone, khơng tan trong nước. Giải ly trên sắc ký bản mỏng bằng hệ dung môi 3H:2AC, quan sát dưới UV 254nm thấy 1 vết rõ đẹp có Rf = 0,57, thay đổi hệ dung môi giải ly bằng 1H:1Ea vẫn thấy 1 vết rõ đây
là chất sạch, không lẫn tạp chất. Phun thuốc thử VS sấy ở nhiệt độ 700C thấy 1 vết màu vàng Nghi ngờ là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.7 Hợp chất HA2 sau khi giải ly trong hệ dung môi
3H:2AC (A) và H:Ea (B)
Hình 3.8 Hợp chất HA2
Quan sát phân đoạn HE6 thấy xuất hiện kết tủa, tiến hành hòa tan bằng các dung môi sau n-hexan, ethyl acetat, chloroform, acetone nhận thấy kết tủa chỉ tan trong
acetone. Lọc tách dịch chiết HE6A và kết tủa HE6B. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều cho tới khi tủa sạch hoàn toàn, thu được hợp chất tinh khiết
Tủa HE6B sau khi rửa liên tục thu được hợp chất đặt tên HA3 là chất có màu vàng tan tốt trong acetone. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng giải ly bằng dung môi 2H:1EA, quan sát dưới đèn UV 254nm thấy xuất hiện vệt hồng lớn nhìn thấy được dưới UV, phun thuốc thử VS sấy ở 70oC thấy xuất hiện vết chính màu vàng rõ đẹp có Rf = 0,148. Thay đổi thành hệ 1H:1Ea để đánh giá độ tinh khiết của HE6B Kết quả sau khi soi dưới đèn UV 254 nm cho thấy xuất hiện duy nhất 1 vết hồng lớn rõ đẹp và có Rf = 0,33, khơng lẫn các chất khác. Nhúng thuốc thử VS sấy ở 70oC thấy chỉ xuất hiện 1 vết vàng duy nhất.
Kết luận: HA3 là một chất có độ phân cực trung bình, nhìn thấy được dưới UV
256nm, và sấy với thuốc thử VS có màu vàng Nghi ngờ HA3 là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.9 Hợp chất HA3 sau khi được giải ly trong hệ dung mơi
Hình 3.10 Hợp chất HA3 3.5.2 Xác định cấu trúc 3.5.2 Xác định cấu trúc
3.5.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất HA1
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Acetone-d6, phụ lục 1, 2) Phổ HSQC, HMBC (Acetone-d6, phụ lục 3, 4).
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA1 cho thấy tín hiệu của ba proton nhân thơm ghép cặp lẫn nhau ở vị trí 1, 2, 4 trên nhân thơm benzene tại H 7.66 (1H, dd, J = 1.50; 8.00 Hz), 7.65 (1H, brs), và H 7.04 (1H, d, J = 8.00 Hz), một proton olefin mũi đơn tại H
6.75; bốn nhóm methoxy tại (δH 4.09; 3.97; 3.90; 3.88). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của mười chín carbon gồm
có: một nhóm carbonyl (δC 183.00), 4 carbon methine thơm và olefin (δC 120.06; 115.60; 109.60; và 103.60), 4 nhóm methoxy (δC 61.40; 61.00; 60.10 và 55.60), 10 carbon thơm tứ cấp trong vùng từ trường 106-165 ppm và 4 nhóm methoxy. Tất cả những dữ kiện này giúp xác định hợp chất HA1 có khung sườn flavone.
Trên nhân thơm A, sự hiện diện của 3 nhóm methoxy và các carbon thơm tứ cấp giúp xác định nhân A có 4 nhóm thế mang oxygen. Nhóm methoxy tại H 4.09 cho tương quan với carbon tại δC 152.00 giúp xác định nhóm này có thể ở vị trí C-5 và C-7. Sự
vắng mặt của nhóm OH kiềm nối khơng giúp kết luận vị trí của nhóm methoxy tại C-5. Tuy nhiên, độ dịch chuyển hóa học của C-4 tại δC 183.00 giúp xác định sự hiện diện của liên kết kiềm nối giữa nhóm 5-OH và C-4 trong khi sự thay thế nhóm 5-OH thành nhóm 5-OCH3 sẽ gây ra sự dịch chuyển về vùng từ trường cao hơn của C-4 (δC 175-179). Hai nhóm methoxy tại δH 3.97 và 3.90 cho tương quan lần lượt với các carbon tại δC 133.00 và 136.00 giúp xác định các nhóm này tại vị trí C-6 và C-8. So sánh dữ liệu phổ của
HA1 với dữ liệu của hợp chất 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'-tetramethoxyflavone ở Bảng 3.6 cho sự tương đồng [27, 70]. Từ những dữ kiện trên giúp kết luận HA1 là 5,4'- dihydroxy-6,7,8,3'-tetramethoxyflavone có cơng thức cấu tạo như Hình 3.11.
Bảng 3.5 So sánh dữ liệu phổ của HA1 với dữ liệu của hợp chất 5,4'-dihydroxy- 6,7,8,3'-tetramethoxyflavone. No. HA1 (Acetone-d6) 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'- tetramethoxyflavone (CDCl3) δHa ppm, J (Hz) δCa ppm δHb ppm, J (Hz) δCb ppm 2 - 164.40 - 164.00 3 6.75 103.00 6.58 103.70 4 - 183.00 - 182.90 4a - 106.70 - 106.70 5 - - - 152.00 6 - 133.00 - 133.00 7 - 152.00 - 149.80 8 - 136.00 - 136.50 8a - 148.00 - 149.50 5-OH - - - -
7-OCH3 4.09 61.40 4.10 61.70 6-OCH3 3.97 61.00 3.96 61.10 8-OCH3 3.90 60.10 3.94 62.10 1 - 122.40 - 123.20 2 7.66 (dd, 8.00; 1.50) 120.60 7.52 (dd, 8.80; 2.00) 120.60 3 7.04 (d, 8.00) 115.60 7.03 (d, 8.80) 108.20 4 - 151.00 - 149.40 5 - 145.70 - 146.90 6 7.65 (brs) 109.60 7.39 (d, 2.00) 115.10 3-OCH3 3.88 55.60 3.99 56.00 5-OH - - 12.54 -
Hình 3.11 Cơng thức của HA1 và tương quan HMBC của HA1
3.5.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất HA2
Hợp chất HA2 thu được từ phân đoạn cao HE của cây Adenosma bracteosum
Bonati. có dạng chất vơ định hình màu vàng.
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Acetone-d6, phụ lục 5, 6). Phổ HSQC, HMBC (Acetone-d6, phụ lục 7, 8, 9).
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA2 cho thấy sự hiện diện của ba proton vòng thơm tại (δH 7.62, d, J = 2.50Hz, H-2'; 7.15, d, J = 8.50Hz, H-5' và 7.72, dd, J = 2.00, 8.50Hz, H-6'), phân tích hằng số ghép J của ba proton giúp xác định proton δH 7.72 ghép orthor với proton δH 7.15 và ghép meta với proton δH 7.62. Ngồi ra cịn có sự xuất hiện một tín hiệu proton olefine mũi singlet (δH 6.78), một tín hiệu OH kiềm nối (δH 12.76, s) và bốn tín hiệu proton methyl mũi đơn (δH 4.00, 4.08, 3.88, 3.96, 3.93).
Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC cho thấy hợp chất HA2 có 22 carbon bao gồm: một tín hiệu ketone tại δC 184.1, bốn tín hiệu carbon olefin tại (δC 107.50, 110.40, 112.80 và 124.30), chín carbon tứ cấp (δC 154.10, 134.10, 146.80, 137.50, 112.80, 124.30, 154.20, 150.70, 110.40) và năm carbon methyl (δC 62.40, 62.10, 61.10, 56.40, 56.40).
Dữ liệu phổ của HA2 giúp xác định đây là hợp chất flavone. Cơng thức hố học của HA2 được xác định bằng tương quan HMBC (Hình 3.13) tín hiệu OH kiềm nối (δH 12.76, s) tương quan carbon C-5 (δC 146.80), C-6 (δC 137.50), C-9 (δC 150.60) giúp xác định vị trí 5-OH, mặt khác proton H-3 (δH 6.78, s) tương quan carbon C-1' (δC 121.20), C-2 (δC 164.60), C-4 (δC 184.10), C-9 (δC 150.60) giúp xác định mối liên kết hai vòng B và C. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của proton H-2' (δH 7.62, d, J = 2.50Hz) với C- 3' (δC 151.60), H-5' (δH 7.15, d, J = 8.50Hz) với C-4' (δC 154.20) cùng với sự dịch chuyển về vùng từ trường thấp của hai carbon C-3' và C-4' giúp xác định vị trí 3'-OMe và 4'- OMe từ đó giúp xác định vị trí của ba nhóm methoxy cịn lại trên vịng A.
So sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HA2 với dữ liệu phổ của hợp chất 5- Demethylnobiletin nhận thấy có sự tương đồng nhất định [43, 72].