3.5.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất HA3
Hợp chất HA3 thu được từ cao phân đoạn HE của cây Adenosma bracteosum
Bonati. có dạng chất vơ định hình màu vàng.
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Acetone-d6, phụ lục 10, 11) Phổ HSQC, HMBC (Acetone-d6, phụ lục 12, 13).
Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA3 cho thấy sự hiện diện của một tín hiệu OH kiềm nối tại (δH 12.96; s; 5-OH), năm proton olefine (δH 7.64; d; J = 3.00Hz; H-2'), (δH 7.63;
d; J = 8.50Hz; H-6'), (δH 7.01; d; J = 8.50Hz; H-5'), (δH 6.85; s; H-8) và (6.74; s; H-3)
và ba nhóm methoxy mũi đơn nằm ở vùng từ trường cao (δH 3.99; 3.98 và 3.80).
Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất HA3 có sự hiện diện của 18 tín hiệu carbon bao gồm: một carbon ketone δC 183.60 (C-4); năm carbon methine δC 123.61 (C-6'); 116.96 (C-5'); 110.64 (C-2'); 104.27 (C-3); 91.98 (C-8); chín carbon tứ cấp δC 165.26 (C-2); 160.13 (C-7); 154.12 (C-5); 154.00 (C-9); 151.61 (C-4'); 148.98 (C-3'); 133.58 (C-6); 121.45 (C-1'); 106.30 (C-10) và ba carbon methyl δC 60.58 (3'-
OMe); 56.84 (6-OMe); 56.62 (7-OMe).
Dữ liệu phổ của HA3 giúp xác định đây là hợp chất flavone. Cơng thức hố học của HA3 được xác định bằng tương quan HMBC (Hình 3.14). Tín hiệu OH kiềm nối (δH 12.76; s) tương quan carbon C-5 (δC 154.12); C-6 (δC 133.58); C-9 (δC 154.00) giúp xác định vị trí 5-OH. Mặt khác khác tương quan HMBC của proton H-8 (δH 6.84; s) với C- 9 (δC 154.00) C-10 (δC 106.30), C-6 (δC 133.58), C-7 (δC 160.13) giúp khẳng định vị trí
H-8 (δH 6.84; s) từ đó xác định vị trí của 6-OMe và 7-OMe trên vịng A. Ngồi ra, proton H-3 (δH 6.78; s) tương quan carbon C-1' (δC 123.61) C-2 (δC 165.28), C-4 (δC 183.60), C-9 (δC 154.00) khẳng định mối liên kết hai vòng B và C, proton H-2' (δH 7.53; s) với C- 3' (δC 148.98), H-5' (δH 6.96; d; J=8.50Hz) với C-4' (δC 151.61) cùng với sự dịch chuyển về vùng từ trường thấp của carbon C-3' (δC 148.98) giúp xác định vị trí 3'-OMe và 4'- OH.
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA3 trong dung môi acetone-d6 vẫn còn lẫn tạp nên
được tiến hành làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột và đo lại phổ 1H-NMR trong dung môi CD3OD.
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA3 đo trong CD3OD cho thấy sự hiện diện của năm proton olefine (δH 7.55; d; J = 8.00 Hz; H-6') (δH 7.53; s; H-2'; 6.96; d; J = 8.75 Hz; H- 5') (δH 6.84; s; H-8 và 6.69; s; H-3) và 3 nhóm methoxy mũi đơn (δH 3.99; 3.99 và 3.96).
So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR của HA3 với dữ liệu phổ cirsilineol (4′,5‐dihydroxy‐3′,6,7‐trimethoxyflavone) nhận thấy có sự tương đồng nhất định [31].
Từ những dữ kiện trên, kết luận HA3 có cơng thức là cirsilineol.
Bảng 3.7 So sánh kết quả dữ liệu phổ của hợp chất HA3 khi đo trong CD3OD và
acetone-d6 và cirsilineol trong pyridine-d6
No HA3 (CD3OD) HA3 Acetone-d6 Cirsilineol Pyridine-d5 δHa ppm, J (Hz) δHa ppm, J (Hz) δCa ppm δHb ppm, J (Hz) δCb ppm 1 - - - - 2 - - 165.28 - 164.97 3 6.69 (1H, s) 6.74 (1H, s) 104.27 7.00 (1H,s) 103.99 4 - - 183.60 - 183.32 5 - - 154.12 - 153.79
6 - - 133.58 - 133.18 7 - - 160.13 - 159.47 8 6.84 (1H, s) 6.85 (1H, s) 91.98 6.87 (1H, s) 91.59 9 - - 154.00 - 153.64 10 - - 106.30 - 106.39 1' - - 123.61 - 122.49 2' 7.53 (1H, s) 7.64 (1H, d, J=3.00 Hz) 110.64 7.66 (1H, s) 110.33 3' - - 148.98 - 149.14 4' - - 151.61 - 152.69 5' 6.96 (1H, d, J=8.50Hz) 7.01 (1H, d, J=8.50 Hz) 116.96 7.31 (1H, d, J=8.85 Hz) 117.06 6' 7.55 (1H, d, J=8.00Hz) 7.63 (1H, d, J=8.50 Hz) 121.45 7.67 (1H, d, J=8.85Hz) 121.42 6-OCH3 3.99 (3H, s) 3.98 (3H, s) 56.68 3.83 (3H, s) 60.41 7-OCH3 3.99 (3H, s) 3.99 (3H, s) 56.85 3.99 (3H, s) 56.21 3'-OCH3 3.86 (3H, s) 3.80 (3H, s) 60.58 3.81 (3H, s) 55.89 4'-OH - 8.55 (1H, s) - - - 5-OH - 12.96 (1H, s) - - -
Hình 3.13 Công thức HA3 và tương quan HMBC của HA3 3.6 Hoạt tính sinh học của hợp chất phân lập được từ cao HE
3.6.1 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase
Ở tiểu đường type 2, việc tăng đường huyết sau khi ăn gây ra stress oxy hóa và rối loạn các chức năng nội mô dẫn đến các biến chứng của tiểu đường. α-amylase tuyến tụy và α-glucosidase trong ruột là 2 enzyme tiêu hóa carbohydrate quan trọng và tăng đường huyết sau ăn. Việc ức chế hoạt động của enzyme α-amylase hoặc α-glucosidase là một phương pháp hiệu quả trong việc làm giảm lượng đường huyết sau ăn nhằm ngăn chặn những biến chứng của tiểu đường type 2.
Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế α-glucosidase
Mẫu thử IC50 (µg/mL) Chất chuẩn Acarbose 87,94 ± 4,08 Cao chiết cồn 26,55 ± 1,57 Cao nước 42,12 ± 3,02 HA1 356,89 ± 2,04 HA2 112,49 ± 2,04 HA3 66,83 ± 1,86
Từ kết quả bảng 3.8 có thể thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết cồn tốt hơn gấp 3,31 lần khi so sánh với chất chuẩn acarbose. So sánh với kết quả khảo sát của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. với IC50 là 481,78 µg/mL (gấp 2,42 lần so với acarbose) thì nhân trần tía đã cho kết quả thể hiện hoạt tính ức chế α- glucosidase tương đồng [81]. Cả 3 hợp chất HA1, HA2 và HA3 đều có kết quả ức chế enzyme α-glucosidase khá mạnh, trong đó HA3 với giá trị IC50 = 66,83 ± 1,86 µg/mL
có hoạt tính mạnh hơn chất chuẩn gấp 1,32 lần. HA1 và HA2 có IC50 lần lượt là 256,89 ± 2,04 µg/mL và 112,49 ± 2,04 µg/mL khi so với acarbose thì hoạt tính kém hơn lần lượt là 4,06 lần và 1,28 lần. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế α-glucosidase của 3 hợp chất HA1, HA2, HA3 từ cao cồn của nhân trần tía lần đầu tiên được cơng bố.
3.6.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư HepG2 và A549
Hoạt tính kháng ung thư của ba hợp chất HA1, HA2 và HA3 được đánh giá thông qua thử nghiệm SRB, nhằm đánh giá độc tính của các chất trên tế bào ung thư thông qua khả năng tiêu diệt tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.
Hình 3.14 Giá trị IC50 của ba hợp chất HA1, HA2, HA3 trên dịng tế bào HepG2
Hình 3.15 Giá trị IC50 của ba hợp chất HA1, HA2, HA3 trên dòng tế bào A549
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Camptothecin HA1 HA2 HA3
13,18 ± 0,14 14,47± 0,09 76,85 ± 0,13 27,77 ± 0,35 IC5 0 µ g /m l 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Camptothecin HA1 HA2 HA3
3,94 ± 0,2 14,85 ± 0,32 80,52 ± 0,3 14,3 ± 0,31 IC5 0 µ g /m l
Kết quả cho thấy cả hai dòng tế bào HepG2 và A549 đều nhạy cảm với cả hai hợp chất HA1 và HA3. Khi tăng nồng độ khảo sát thì phần trăm lượng tế bào chết cũng tăng theo. Từ biểu đồ hình 3.14 có thể thấy trên dịng tế bào ung thư gan HepG2 được nghiên cứu, hợp chất HA1 và HA3 đều thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 14,47 ± 0,09 µg/mL và 27,77 ± 0,35 µg/mL gần tương đương với thuốc chống ung thư là camptothecin lần lượt 1,1 lần và 2,1 lần. Đối với dịng tế bào ung thư phổi A549, biểu đồ hình 3.15 cho thấy giá trị IC50 của HA1 và HA3 lần lượt là 14,85 ± 0,32 µg/mL và 14,3 ± 0,31 µg/mL kém hơn 3,77 lần và 3,63 lần khi so sánh với camptothecin. Từ đó nhận thấy cả 2 hợp chất đều có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư gan tốt hơn ung thư phổi. Hợp chất HA1 được phân lập từ cây trà thảo mộc Rabdosia rubescens đã được
chứng minh bởi Bai và cộng sự là hoạt động có chọn lọc chống lại các tế bào HL-60 với IC50 là 7,55 μM (so sánh với doxorubicin có IC50 4,64 μM) [9]. HA1 được tách chiết từ
Baccharis densiflora cịn có khả năng gây độc trên tế bào ung thư vú với nồng độ > 100
μM [61]. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Yanagimichi (2021), HA3 được chiết xuất từ cây Salvia officinalis cũng cho kết quả kháng ung thư tiềm năng trên 2 dịng tế bào HepG2 và A549 [77]. Ngồi ra, HA3 đã được báo cáo là có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư phát triển như tế bào Caov-3, HeLa, MK-1, Skov-3, B16F10, PC3, MCF- 7 và kháng khuẩn, ức chế gốc tự do [4, 26, 31, 34, 36, 59].
Từ 2 biểu đồ trên cũng biểu thị hoạt tính chống 2 dịng tế bào ung thư HepG2 và A549 của HA2 kém hơn HA1 và HA3 với IC50 lần lượt bằng 76,85 ± 0,13 µg/mL và 80,53 ± 0,3 µg/mL kém 5,8 và 20,44 lần so với camptothecin. Từ đó cho thấy HA2 có hoạt tính tương đối tốt trên tế bào ung thư gan nhưng khá kém đối với tế bào ung thư phổi A549.
Kết quả đánh giá hoạt tính của cả 3 hợp chất HA1, HA2, HA3 trên 2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 và ung thư phổi A549 lần đầu tiên được công bố trên lồi nhân trần tía. Kết quả này đã góp phần bổ sung thêm một nguồn thông tin quý giá để khẳng
định trong cây nhân trần tía có những chất có khả năng chống oxy hóa, gây độc lên các dịng tế bào ung thư.
Kết quả nghiên cứu chứng minh rằng cao cồn nhân trần tía thể hiện hoạt tính khá tốt trên hai dịng tế bào HepG2 và A549. Từ đó, cho thấy tiềm năng sinh học của nhân trần tía cũng như các hợp chất có trong cây, giúp mở ra nhiều hướng ứng dụng cũng như phân tích sâu hơn về hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên có trong lồi thực vật này.
Những kết quả này cũng cho thấy rằng cả 3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tốt đều có hoạt tính chống lại tế bào ung thư tiềm năng. Ngồi ra, việc ức chế enzyme α-glucosidase cịn giảm lượng đường trong máu sau ăn giúp ngăn ngừa đái tháo đường type 2 và các biến chứng của bệnh. Ngày càng có nhiều bằng chứng chứng minh mối liên hệ giữa đái tháo đường (chủ yếu là loại 2) và ung thư. Nhiều phân tích tổng hợp dữ liệu dịch tễ học cho thấy những người mắc đái tháo đường có nguy cơ phát triển nhiều loại ung thư khác nhau, cùng với đó là tăng nguy cơ tử vong do ung thư [23]. Từ những kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy cây nhân trần tía có hoạt tính sinh học tốt, có thể ứng dụng vào thực tiễn để sản xuất ra các loại thuốc, thực phẩm chức năng hỗ trợ và phịng bệnh liên quan đến stress oxy hóa, hỗ trợ và điều trị ung thư.
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1 Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài, với điều kiện phịng thí nghiệm Hợp chất tự nhiên, đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài đã thực hiện được một số công việc sau:
Về độ ẩm và hàm lượng cao chiết:
Độ ẩm nguyên liệu sau khi xử lý là bột cây nhân trần tía với 6,18% khơng quá 13% vẫn đảm bảo cho việc bảo quản.
Hàm lượng cao thu được khi sử dụng dung môi nước, dung môi cồn và dung môi H :Ea (1:1) để chiết lần lượt là 16,05%, 9,17% và 6,25%.
Về thành phần hóa học:
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong cao cồn của cây Nhân trần tía bằng phương pháp GC-MS thì xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học như: Methyl carvacrol, β-Bisabolene, Cis-Lanceol, Phytol, Humulene, Acid linoleic liên hợp.
Về khả năng gây độc tế bào:
Nghiên cứu khả năng gây độc trên loài bào xác Artemia thu được kết quả:
- Cao chiết cồn có hoạt tính gây độc với giá trị LC50 (647,64) µg/mL tốt hơn cao nước gần như khơng có khả năng này (>1000) µg/mL.
- Tất cả các cao phân đoạn của cao cồn, cao phân đoạn HE có hoạt tính mạnh nhất (210,73) µg/mL trong các cao cịn lại (>1000) µg/mL.
Về khả năng gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư HepG2 và A549:
Cao cồn đều cho thấy khả năng kháng 2 dòng ung thư khá tốt với kết quả sau: - Đối với tế bào ung thư gan HepG2, cao cồn có IC50 (38,15 ± 0,61) µg/mL chỉ kém 2,8 lần so với đối chứng thuốc điều trị ung thư là camptothecin (13,18 ± 0,14) µg/mL. - Đối với dịng tế bào ung thư phổi A549, khi so với đối chứng camptothecin (3,94 ± 0,2) µg/mL thì cao cồn (13,1 ± 1,12) µg/mL chỉ thấp hơn 3,3 lần.
Đã thu được 3 hợp chất tinh khiết, xác định được công thức và định danh:
HA1: 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'-tetramethoxyflavone.
HA2: 5-Demethylnobiletin
HA3: Cirsilineol.
Trong đó HA1 đã được nhóm cơng bố trước đó và HA2 chưa có cơng bố khoa học nào về hợp chất tự nhiên này có trong nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.)
Hoạt tính sinh học của HA1, HA2, HA3:
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase: cả 3 hợp chất đều có hoạt tính khá mạnh, trong đó HA3 ức chế tốt nhất với IC50 (66,83 ± 1,86) µg/mL so với 2 hợp chất HA1
(356,89 ± 2,04) µg/mL và HA2 (112,49 ± 2,04) µg/mL. Kết quả thử nghiệm khả năng
ức chế α-glucosidase của 3 hợp chất HA1, HA2, HA3 từ cao cồn của nhân trần tía lần
đầu tiên được cơng bố.
Khả năng gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư HepG2 và A549: 2 hợp chất HA1,
HA3 có hoạt tính mạnh hơn hẳn HA2. Và lần đầu tiên kết quả đánh giá của 3 hợp chất
này được phân lập từ cây nhân trần tía trên 2 dịng tế bào ung thư gan HepG2 và ung thư phổi A549 được công bố.
4.2 Kiến nghị
Do điều kiện thực nghiệm và thời gian thực hiện đề tài có hạn, đề tài mới chỉ nghiên cứu một phần nhỏ thành phần hố học của cao cồn Nhân trần tía. Để tiếp tục, đề tài nên tập trung vào các nội dung sau:
Xử lý tiếp các phân đoạn còn lại của dịch chiết cồn để tách các chất phân cực hơn.
Tiếp tục triển khai sắc ký cột cổ điển để thu được các hợp chất phân cực hơn đặc biệt là flavonoid.
Tiếp tục thử nghiệm và khảo sát thêm các hoạt tính sinh học của các hợp chất, đặc biệt là HA1, HA3 và các dẫn xuất của HA2
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
1. Ngoc Hong Nguyen, Qui Thanh Hoai Ta, Quang Thang Pham, Thi Ngoc Han Luong, Van Trung Phung, Thuc-Huy Duong and Van Giau Vo. Anticancer Activity of
Novel Plant Extracts and Compounds from Adenosma bracteosum (Bonati) in Human Lung and Liver Cancer Cells. Molecules (2020).
2. Luong Thi Ngoc Han, Nguyen Ngoc Hong, Thai Thi Diem Uyen, Ngo Ngoc
Phuong Ngoan, Ma Phu Cuong. Anticancer Activity Of The Compound Isolate From Adenosma bracteosum Bonati. The 2nd International Conference on Science, Technology and Society Studies (STS) (2021).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh:
1. Adoum, OA, Dabo, NT, and Fatope, MO (1997), "Bioactivities of some savanna plants in the brine shrimp lethality test and in vitro antimicrobial assay",
International Journal of Pharmacognosy. 35(5), pp. 334-337.
2. Alwan, Ala (2011), Global status report on noncommunicable diseases 2010,
World Health Organization.
3. Anderson, JE, et al. (1991), "A blind comparison of simple bench‐top bioassays and human tumour cell cytotoxicities as antitumor prescreens", Phytochemical analysis. 2(3), pp. 107-111.
4. Angiolella, Letizia, Sacchetti, Gianni, and Efferth, Thomas (2018), "Antimicrobial and antioxidant activities of natural compounds", Hindawi. 5. AOAC (2012), "Guidelines for Standard Method Performance Requirements". 6. Arcanjo, Daniel Dias Rufino, et al. (2012), "Bioactivity evaluation against
Artemia salina Leach of medicinal plants used in Brazilian Northeastern folk medicine", Brazilian Journal of Biology. 72, pp. 505-509.
7. Austgulen LT, Solheim E, and RR, Scheline (2009), "Metabolism in rats of p cymene derivatives: carvacrol and thymol", School of Medicine University of Bergen. 4(3), pp. 15-17.
8. Awachie, PIA and Ugwu, FO (1997), "Preliminary investigation of the antimicrobial and brine shrimp lethality properties of some Nigerian medicinal plants", International journal of pharmacognosy. 35(5), pp. 338-343.
9. Bai, Naisheng, et al. (2010), "Flavonoids from Rabdosia rubescens exert anti- inflammatory and growth inhibitory effect against human leukemia HL-60 cells",
Food Chemistry. 122(3), pp. 831-835.
10. Bakkali, F., et al. (2007), "Biological effects of essential oils - A review", Food
11. Beloz, Alfred (1992), "Brine shrimp bioassay screening of two medicinal plants used by the Warao: Solanum straminifolium and Virola surinamensis", Journal
of ethnopharmacology.
12. Bentham, George (1876), Genera plantarum ad exemplaria imprimis in herbariis
Kewensibus servata definita: Sistens dicotyledonum gamopetalarum ordines XXXIX: stylidieas-plantagineas, Vol. 2, Reeve.
13. Bhandari, Megh Raj, et al. (2008), "α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activities of Nepalese medicinal herb Pakhanbhed (Bergenia ciliata, Haw.)", Food
Chemistry. 106(1), pp. 247-252.
14. Carini, F, et al. (2017), "Colorectal cancer and inflammatory bowel diseases: effects of diet and antioxidants", Biol Regul Homeost Agents. 31(3), pp. 791-5. 15. Chavez, PI, et al. (1997), "Cytotoxicity correlations of Puerto Rican plants using
a simplified brine shrimp lethality screening procedure", International journal of
pharmacognosy. 35(4), pp. 222-226.
16. Dai, Do N, et al. (2015), "Chemical constituents of leaf essential oils of four Scrophulariaceae species grown in Vietnam", Journal of Essential Oil Research.