Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2 Xác định hàm lượng cao chiết
Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng cao chiết
Dược liệu Hàm lượng cao (%)
Nhân trần tía Cao nước Cao cồn Cao HE
16,05 ± 0,25 9,17 ± 0,10 6,25 ± 0,18
Độ ẩm cao chiết (%)
5% 5% 5%
Hàm lượng chiết của cao nước cao hơn cao cồn, chứng tỏ trong cây nhân trần tía chứa một lượng lớn hợp chất có độ phân cực mạnh nên tan được trong nước. Nguyên nhân khác là do khi chiết bằng ethanol nồng độ cao, ethanol sẽ háo nước làm các thành tế bào bị mất nước cục bộ dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khô và co lại ngăn cản quá trình chiết, đồng thời nhiều hợp chất khác cũng được chiết ra khỏi tế bào như chlorophyll... làm cho dịch trích chuyển sang màu xanh lục. Nhưng dung mơi nước chỉ có thể chiết được những chất có độ phân cực cao, cịn dung mơi cồn có thể chiết được hầu hết các chất có độ phân cực từ thấp đến cao trong cây [87]. Dạng cao sử dụng là
dạng bột khô với độ ẩm là 5% khơng cịn dư lượng ethanol, hexan, ethylacetate để không ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm.
3.3 Đánh giá hoạt tính gây độc trên hai dịng tế bào HepG2 và A549 của cao chiết cồn nhân trần tía
Hợp chất tự nhiên có khả năng kháng ung thư theo hai cách: trực tiếp tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách gây độc tế bào, làm giảm quá trình phân bào, kích thích tế bào đi vào q trình apoptosis; hoặc gián tiếp thơng qua việc làm giảm máu đến khối u, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. Trong đó, khả năng gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên đang được quan tâm với nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về lĩnh vực này. Tính gây độc tế bào của một hợp chất tự nhiên được định nghĩa là khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào, làm tế bào dừng tăng trưởng và phân chia hoặc đưa tế bào đi vào q trình apoptosis [29].
Hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư A549 và HepG2 của cao chiết cồn nhân trần tía được đánh giá thơng qua thử nghiệm SRB nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết cồn, kết quả thử nghiệm được so sánh với chất đối chứng là camptothecin và tiêu chí của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ.
Camptothecin được sử dụng làm đối chứng dương trong thí nghiệm này là một loại thuốc điều trị bệnh ung thư theo cơ chế gây độc topoisomerase. Hoạt tính gây độc tế bào của camptothecin là liên kết với phức hợp topoisomerase I và DNA (phức hợp cộng hóa trị) dẫn đến phức hợp ternary và ổn định nó. Điều này ngăn chặn sự thắt lại DNA và do đó gây ra thiệt tổn thương DNA dẫn đến apoptosis [19].
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao cồn nhân trần tía được thể hiện theo biểu đồ hình dưới đây:
Hình 3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính trên dịng tế bào ung thư gan HepG2
Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính trên dịng tế bào ung thư phổi A549
Theo tài liệu của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, trong nghiên cứu khả năng chống tăng sinh tế bào Ung thư của dược liệu, những cao tổng của dược liệu cho kết quả IC50 dưới 50 g/ml chứng tỏ dược liệu này có khả năng kháng tế bào ung thư khá mạnh [24]. Cao cồn của Nhân trần tía đã cho kết quả khá ổn với giá trị IC50 trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 là 38,15 ± 0,61 µg/mL và ung thư phổi A549 là 13,1 ± 1,12 µg/mL kém lần
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Cao cồn Camptothecin 38,15 ± 0,61 13,18 ± 0,14 IC5 0 µ g /m l 0 2 4 6 8 10 12 14 Cao cồn Camptothecin 13,1 ± 1,12 3,94 ± 0,2 IC5 0 µ g /m l
lượt 2,8 lần và 3,3 lần so với đối chứng thuốc chống ung thư camptothecin được thử nghiệm ở cùng nồng độ. Trước đó, trong nghiên cứu của Nguyen Ngoc Hong và đồng cộng sự cũng đã cho thấy rằng cao cồn nhân trần tía cũng thể hiện hoạt tính gây độc khá tốt trên dòng tế bào ung thư phổi khác là NCI-H460 với IC50 = 30,31 ± 1,60 μg/mL và ở kết quả nghiên cứu này cao cồn nhân trần tía cũng thể hiện hoạt tính tương tự trên dịng tế bào ung thư phổi khác là A549, được biết dòng tế bào A549 mạnh hơn dòng tế bào NCI-H460 [68]. Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2010) đã khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư của Nhân trần nam Adenosma caeruleum, so sánh với kết quả với nhóm nghiên cứu này cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum đã cho kết quả tương đương về khả
năng ức chế trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 [66]. Trong một nghiên cứu của Thiard Franck và cộng sự vào năm 2008, nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát 30 cao chiết từ 19 loài cây thường dùng trong dân gian miền Nam Việt Nam để chữa u nhọt, ung thư thì chỉ có 7 cao thể hiện hoạt tính; một nghiên cứu khác với 31 dược liệu dùng chữa bệnh ung thư ở miền Bắc Việt Nam của Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2010) chỉ thu được kết quả khả quan trên 9 loài [83, 66]. Việc phát hiện ra một dược liệu có khả năng kháng ung thư là khơng đơn giản, đề tài này đã góp phần bổ sung thêm một nguồn thông tin quý giá để làm nền tảng nghiên cứu sâu hơn về thành phần và cơ chế kháng ung thư của Nhân trần tía.
3.4 Khảo sát sơ bộ độc tính cytotoxic trên bào xác Artemia
Phương pháp này có liên quan đáng kể đến việc ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư ở người được chứng minh bởi Viện Ung thư Quốc gia (NCI, Hoa Kì) và cho thấy giá trị của phương pháp này như một công cụ sàng lọc trước khi đưa vào nghiêm cứu thuốc chống ung thư [3]. Thử nghiệm này cũng có tương quan khá tốt với hoạt tính gây độc tế bào và có thể được sử dụng để khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học [6].
Hình 3.3 Tỉ lệ chết Artemia của các cao chiết và cao phân đoạn
từ Nhân trần tía sau 24h
Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của các cao chiết.
Cao chiết LC50 (µg/mL)
Cao cồn 647,64
Cao nước >1000
Cao phân đoạn HE 210,73
Cao phân đoạn Ethylacetate >1000
Cao phân đoạn n-butanol >1000
Potassium Dichromate (chứng dương) 27,75
Như thể hiện trong hình 3.3, độc tính tế bào chứng tỏ mối quan hệ giữa nồng độ của các mẫu và mức độ gây độc tế bào, từ đó cho biết các mẫu nào có hoạt tính sinh học. Từ bảng 3.3 cho thấy giá trị LC50 của cao chiết cồn sau 24h là 647,64 µg/mL, có thể
0 20 40 60 80 100 120 6 . 2 5 1 2 . 5 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 1 0 0 0 T ỷ lệ c h ết (% ) Nồng độ mẫu (µg/mL)
Potassium Dichromate Cao cồn
Cao nước Cao phân đoạn HE
chứng tỏ rằng cao cồn có hoạt tính gây độc khá mạnh đối với Artemia (LC50 < 1,0 mg/mL) [39]. Các cao phân đoạn của cao chiết cồn trong đó có cao phân đoạn HE thể hiện hoạt tính tốt nhất với LC50 là 210,73 µg/mL. Các cao phân khác như ethyacetate, n- butanol, cao nước có LC50 > 1000 µg/mL được coi là khơng có hoạt tính. Như vậy có thể thấy cao phân đoạn HE có tiềm năng phân lập được hợp chất tự nhiên có khả năng chống tế bào ung thư.
3.5 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao phân đoạn HE 3.5.1 Phân lập 3.5.1 Phân lập
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả sắc ký cột cao HE thu được 6 phân đoạn. Các phân đoạn được đánh giá bằng sắc ký bản mỏng trong nhiều hệ dung môi khác nhau để tiến hành sắc ký cột thu nhận hợp chất tinh khiết.
Bảng 3.4 Các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột
Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi rửa giải Khối lượng
HE1 1 2H:1EA 1,78g HE2 2 2H:1EA 1,51g HE3 3-4 2H:1EA 2,46g HE4 5-10 2H:1EA 1,82g HE5 11-14 2H:1EA 2,58g HE6 15-18 2H:1EA 1,72g
Hình 3.4 Bảng sắc ký của cao HE sau khi giải ly ở hệ dung môi H:Ea (1:1)
Từ 6 phân đoạn thu được sau khi rửa giải cao HE trong hệ dung môi 2H:1EA, nhận thấy phân đoạn HE5 có khối lượng nhiều nhất và cho các vết rõ đẹp sau khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng nên chọn phân đoạn HE5 để tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trong hệ dung môi 7H:3EA.
Sau khi rửa giải, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp chung những lọ giống nhau. Kết quả thu được từ HE5 cho ra thêm 4 phân đoạn khác từ A5.1 đến A5.4. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng, nhận thấy phân đoạn A5.4 chứa 2 vết chính rõ đẹp nên được khảo sát trước, các phân đoạn còn lại được nghiên cứu sau.
Sau khi kết thúc rửa giải kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng. Hợp chất thu được được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng ở nhiều hệ dung môi khác nhau nhằm đảm bảo độ tinh khiết
Phân đoạn A5.4 được sắc ký cột nhiều lần bằng hệ dung mơi 1H:4C thì thu được hợp chất HA1, HA2. Hợp chất HA1 được kiểm tra qua nhiều hệ dung môi để đánh giá độ tinh khiết. Hợp chất HA1 có những đặc điểm sau:
• Hợp chất có màu vàng, kết tinh hình kim.
• Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly 1H:4C cho một vết với Rf = 0,73, tiếp tục thay đổi hệ giải ly 3H:1Ea thu được 1 vết tròn, rõ với Rf = 0,34, chứng tỏ đây là chất sạch.
Cho giải ly hấp thu UV 254m, tiếp theo nhúng với thuốc thử 5% vanillin/ EtOH và sau khi sấy ở nhiệt độ 700C cho một vết màu vàng duy nhất. Nghi ngờ là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.5 Hợp chất HA1 sau khi được giải ly trong hệ dung môi
1H:4C (A) và 3H:1Ea (B)
Hình 3.6 Hợp chất HA1
Hợp chất HA2 là chất có màu vàng, tan trong acetone, khơng tan trong nước. Giải ly trên sắc ký bản mỏng bằng hệ dung môi 3H:2AC, quan sát dưới UV 254nm thấy 1 vết rõ đẹp có Rf = 0,57, thay đổi hệ dung môi giải ly bằng 1H:1Ea vẫn thấy 1 vết rõ đây
là chất sạch, không lẫn tạp chất. Phun thuốc thử VS sấy ở nhiệt độ 700C thấy 1 vết màu vàng Nghi ngờ là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.7 Hợp chất HA2 sau khi giải ly trong hệ dung môi
3H:2AC (A) và H:Ea (B)
Hình 3.8 Hợp chất HA2
Quan sát phân đoạn HE6 thấy xuất hiện kết tủa, tiến hành hịa tan bằng các dung mơi sau n-hexan, ethyl acetat, chloroform, acetone nhận thấy kết tủa chỉ tan trong
acetone. Lọc tách dịch chiết HE6A và kết tủa HE6B. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều cho tới khi tủa sạch hoàn toàn, thu được hợp chất tinh khiết
Tủa HE6B sau khi rửa liên tục thu được hợp chất đặt tên HA3 là chất có màu vàng tan tốt trong acetone. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng giải ly bằng dung môi 2H:1EA, quan sát dưới đèn UV 254nm thấy xuất hiện vệt hồng lớn nhìn thấy được dưới UV, phun thuốc thử VS sấy ở 70oC thấy xuất hiện vết chính màu vàng rõ đẹp có Rf = 0,148. Thay đổi thành hệ 1H:1Ea để đánh giá độ tinh khiết của HE6B Kết quả sau khi soi dưới đèn UV 254 nm cho thấy xuất hiện duy nhất 1 vết hồng lớn rõ đẹp và có Rf = 0,33, khơng lẫn các chất khác. Nhúng thuốc thử VS sấy ở 70oC thấy chỉ xuất hiện 1 vết vàng duy nhất.
Kết luận: HA3 là một chất có độ phân cực trung bình, nhìn thấy được dưới UV
256nm, và sấy với thuốc thử VS có màu vàng Nghi ngờ HA3 là một flavonoid.
(A) (B)
Hình 3.9 Hợp chất HA3 sau khi được giải ly trong hệ dung môi
Hình 3.10 Hợp chất HA3 3.5.2 Xác định cấu trúc 3.5.2 Xác định cấu trúc
3.5.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất HA1
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Acetone-d6, phụ lục 1, 2) Phổ HSQC, HMBC (Acetone-d6, phụ lục 3, 4).
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA1 cho thấy tín hiệu của ba proton nhân thơm ghép cặp lẫn nhau ở vị trí 1, 2, 4 trên nhân thơm benzene tại H 7.66 (1H, dd, J = 1.50; 8.00 Hz), 7.65 (1H, brs), và H 7.04 (1H, d, J = 8.00 Hz), một proton olefin mũi đơn tại H
6.75; bốn nhóm methoxy tại (δH 4.09; 3.97; 3.90; 3.88). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của mười chín carbon gồm
có: một nhóm carbonyl (δC 183.00), 4 carbon methine thơm và olefin (δC 120.06; 115.60; 109.60; và 103.60), 4 nhóm methoxy (δC 61.40; 61.00; 60.10 và 55.60), 10 carbon thơm tứ cấp trong vùng từ trường 106-165 ppm và 4 nhóm methoxy. Tất cả những dữ kiện này giúp xác định hợp chất HA1 có khung sườn flavone.
Trên nhân thơm A, sự hiện diện của 3 nhóm methoxy và các carbon thơm tứ cấp giúp xác định nhân A có 4 nhóm thế mang oxygen. Nhóm methoxy tại H 4.09 cho tương quan với carbon tại δC 152.00 giúp xác định nhóm này có thể ở vị trí C-5 và C-7. Sự
vắng mặt của nhóm OH kiềm nối khơng giúp kết luận vị trí của nhóm methoxy tại C-5. Tuy nhiên, độ dịch chuyển hóa học của C-4 tại δC 183.00 giúp xác định sự hiện diện của liên kết kiềm nối giữa nhóm 5-OH và C-4 trong khi sự thay thế nhóm 5-OH thành nhóm 5-OCH3 sẽ gây ra sự dịch chuyển về vùng từ trường cao hơn của C-4 (δC 175-179). Hai nhóm methoxy tại δH 3.97 và 3.90 cho tương quan lần lượt với các carbon tại δC 133.00 và 136.00 giúp xác định các nhóm này tại vị trí C-6 và C-8. So sánh dữ liệu phổ của
HA1 với dữ liệu của hợp chất 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'-tetramethoxyflavone ở Bảng 3.6 cho sự tương đồng [27, 70]. Từ những dữ kiện trên giúp kết luận HA1 là 5,4'- dihydroxy-6,7,8,3'-tetramethoxyflavone có cơng thức cấu tạo như Hình 3.11.
Bảng 3.5 So sánh dữ liệu phổ của HA1 với dữ liệu của hợp chất 5,4'-dihydroxy- 6,7,8,3'-tetramethoxyflavone. No. HA1 (Acetone-d6) 5,4'-dihydroxy-6,7,8,3'- tetramethoxyflavone (CDCl3) δHa ppm, J (Hz) δCa ppm δHb ppm, J (Hz) δCb ppm 2 - 164.40 - 164.00 3 6.75 103.00 6.58 103.70 4 - 183.00 - 182.90 4a - 106.70 - 106.70 5 - - - 152.00 6 - 133.00 - 133.00 7 - 152.00 - 149.80 8 - 136.00 - 136.50 8a - 148.00 - 149.50 5-OH - - - -
7-OCH3 4.09 61.40 4.10 61.70 6-OCH3 3.97 61.00 3.96 61.10 8-OCH3 3.90 60.10 3.94 62.10 1 - 122.40 - 123.20 2 7.66 (dd, 8.00; 1.50) 120.60 7.52 (dd, 8.80; 2.00) 120.60 3 7.04 (d, 8.00) 115.60 7.03 (d, 8.80) 108.20 4 - 151.00 - 149.40 5 - 145.70 - 146.90 6 7.65 (brs) 109.60 7.39 (d, 2.00) 115.10 3-OCH3 3.88 55.60 3.99 56.00 5-OH - - 12.54 -
Hình 3.11 Cơng thức của HA1 và tương quan HMBC của HA1
3.5.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất HA2
Hợp chất HA2 thu được từ phân đoạn cao HE của cây Adenosma bracteosum
Bonati. có dạng chất vơ định hình màu vàng.
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Acetone-d6, phụ lục 5, 6). Phổ HSQC, HMBC (Acetone-d6, phụ lục 7, 8, 9).
Phổ 1H-NMR của hợp chất HA2 cho thấy sự hiện diện của ba proton vòng thơm tại (δH 7.62, d, J = 2.50Hz, H-2'; 7.15, d, J = 8.50Hz, H-5' và 7.72, dd, J = 2.00, 8.50Hz, H-6'), phân tích hằng số ghép J của ba proton giúp xác định proton δH 7.72 ghép orthor với proton δH 7.15 và ghép meta với proton δH 7.62. Ngồi ra cịn có sự xuất hiện một tín hiệu proton olefine mũi singlet (δH 6.78), một tín hiệu OH kiềm nối (δH 12.76, s) và bốn tín hiệu proton methyl mũi đơn (δH 4.00, 4.08, 3.88, 3.96, 3.93).
Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC cho thấy hợp chất HA2 có 22 carbon bao gồm: một tín hiệu ketone tại δC 184.1, bốn tín hiệu carbon olefin tại (δC 107.50, 110.40, 112.80