Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.6.3 Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư
Thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - bộ môn Di Truyền, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP.HCM.
Nguyên tắc:
Tế bào ung thư được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng, sau khi đạt mật độ phù hợp sẽ được chuyển vào bộ 96 giếng. Pha dịch chiết cần khảo sát ở nồng độ thiết kế và cho cảm ứng với tế bào ung thư. Sau thời gian ủ cố định, sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) để xác định kết quả.
Phương pháp SRB là phương pháp phổ biến đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in
vitro thông qua việc đánh giá protein tổng của tế bào. Phương pháp này được sử dụng
chủ yếu cho thử nghiệm độ nhạy cảm với thuốc vì sự tương thích cũng như dễ dàng áp dụng cho thử nghiệm hàng loạt. SRB là một chất nhuộm animoxanthene có thể kết hợp với amino acid tính kiềm thơng qua nhóm sulfuric. Sự kết hợp này xảy ra theo nguyên
lý cân bằng hóa học, do đó độ thay đổi màu sắc cho phép ước lượng lượng protein tổng, từ đó suy ra số lượng tế bào [29, 71].
Đối tượng thử nghiệm: dòng tế bào ung thư gan HepG2, ung thư phổi A549.
Quy trình:
Dịng tế bào ung thư phổi (A549) và ung thư gan (HepG2) do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong mơi trường E’MEM có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 μg/ml), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò (FBS) và ủ ở 37oC, 5% CO2. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng đối với dòng tế bào HepG2, 7,5x103 tế bào/giếng đối với dịng A549. Sau 24 giờ ni cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn [45].
Xử lý kết quả
Phần trăm tế bào ung thư bị ức chế khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
I% = ( 1-[ 𝑂𝐷𝑚ẫ𝑢
𝑂𝐷𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘] ) x 100%
I%: % tế bào bị ức chế
IC50 được xác định như sau:
Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (Pérez Lynette Bueno, et al.) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel [54]. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỉ lệ gây chết tế bào 50% bằng cách:
Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào gần 50% nhất (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm cịn lại có tỉ lệ gây độc tế bào lớn hơn
50%).
Từ phương trình có dạng y = ax + b tính được giá trị IC50