Caspase là enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis. Một khi tế bào bị các tác nhân gây apoptosis kích thích, các caspase sẽ được hoạt hóa. Chính vì thế, việc xác định sự hoạt động của caspase là một trong những cách nhằm kiểm tra một chất hoặc một hợp chất có khả năng cảm ứng apoptosis hay không.
Caspase-3 là một caspase hành sự giữ vai trò quan trọng trong việc thi hành apoptosis. Dù là sự hoạt hóa apoptosis thông qua con đường ngoại bào hay nội bào, nhưng cuối cùng cũng đều chung một mục tiêu là hoạt hóa các caspase hành sự, đặc biệt là caspase-3. Khi các caspase hành sự được hoạt hóa sẽ phân cắt các protein khác dẫn đến sự thay đổi kiểu hình đặc trưng cho tế bào apoptosis như : tế bào co tròn lại, tế bào tạo bóng màng (blebbing), nhiễm sắc chất cô đặc và DNA bị phân
mảnh. Và một điểm quan trọng là sự phân mảnh của DNA là do sự tác động của caspase-3 trong con đường apoptosis phụ thuộc caspase. Vì thế, chúng tôi chọn caspase-3 làm đối tượng cho thử nghiệm xác định hoạt tính caspase.
Để đánh giá hoạt tính caspase-3, ban đầu chúng tôi thiết lập thử nghiệm với 4 thời điểm khảo sát (24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ). Chúng tôi chọn những thời điểm khảo sát như thế là do ở 24 giờ quần thể tế bào HeLa xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng đã bắt đầu có hiện tượng tạo bóng màng và cô đặc nhiễm sắc chất (mục 3.4.1), đó là kết quả từ sự hoạt động của các caspase hành sự. Tuy nhiên, ở lần thử nghiệm thứ nhất, chúng tôi nhận thấy hoạt tính caspase-3 không thay đổi trong suốt thời gian khảo sát (số liệu trình bày trong phần phụ lục).
Thử nghiệm hoạt tính caspase là một phương pháp định lượng, tỉ lệ tín hiệu thu nhận được tương ứng với lượng caspase-3 hoạt động trong mẫu phân tích. Có thể là ở hai thời điểm cảm ứng 24 giờ và 36 giờ, số lượng tế bào trong quần thể bị apoptosis chưa nhiều, nên tín hiệu caspase-3 hoạt động có thể thấp khó phát hiện. Đồng thời, khi kết hợp với kết quả của phần thử nghiệm DNA phân mảnh ở trên (mục 3.4.2), chúng tôi thấy ở thời điểm 48 giờ tuy xuất hiện thang DNA nhưng lượng DNA kích thước lớn vẫn còn khá nhiều, chứng tỏ caspase-3 có thể vẫn còn hoạt động mạnh sau thời điểm 48 giờ cảm ứng. Ở thời điểm 72 giờ, chúng tôi không thu nhận được thang DNA, như đã nói ở trên, có thể các thể apoptotic đã bị ly giải làm cho caspase-3 cũng như các protein khác có thể cũng đã bị các protease phá hủy. Chính vì thế, chúng tôi quyết định chọn hai thời điểm là 48 giờ và 60 giờ để tiếp tục khảo sát hoạt tính của caspase-3.
Quần thể tế bào HeLa được cảm ứng với cao chiết cồn nấm Linh chi vàng ở nồng độ IC50 = 92,6 µg/ml. Đối chứng là quần thể tế bào không xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng. Sau 48 giờ và 60 giờ cảm ứng, chúng tôi thu nhận kết quả hoạt tính caspase-3 và trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả hoạt tính caspase-3 của quần thể tế bào Hela ở những thời điểm khác nhau
Thời điểm Hoạt động caspase-3TB ± ĐLC
48 giờ 1,04 (a) ± 0,20
60 giờ 0,88 (a) ± 0,25
(a) : thể hiện những nhóm có hoạt tính gây độc tế bào ung thư nuôi cấy khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Số liệu ở bảng 3.8 cho thấy, sau 48 giờ và 60 giờ, độ hoạt động của caspase-3 không tăng so với mẫu đối chứng. Chứng tỏ, con đường gây apoptosis của cao chiết cồn Linh chi vàng không thông qua hoạt động của caspase-3.
Một số nghiên cứu cho thấy, endonuclease G - một enzyme được giải phóng từ ty thể khi tế bào bị cảm ứng apoptosis có khả năng trực tiếp phân cắt DNA, sự phân cắt này độc lập với hoạt động của CAD. Endonuclease G cũng phân cắt DNA ở vị trí giữa các nucleosome, thể hiện sự phân cắt DNA với kiểu hình apoptosis thông thường và
đặc biệt endonuclease G không chịu ảnh hưởng tác động của caspase. Vì thế
caspase-3 không cần thiết cho sự phân cắt DNA dưới tác động của endonuclease G [45], [48]. Một protein gọi là AIF (apoptosis-inducing factor) cũng được giải phóng từ ty thể khi tế bào bị cảm ứng apoptosis. AIF có khả năng phân cắt DNA thành những phân mảnh lớn khoảng 50kb và làm cô đặc nhiễm sắc chất [14].
Caspase-7 cũng như caspase-3 đều có thể phân cắt ICAD để hoạt hóa CAD phân mảnh DNA [57].Theo nghiên cứu của Margaret M. Mc Geea (2002), một chất gọi là pyrrolo-1,5-benzoxazepine (PBOX-6) có thể hoạt hóa caspase-7, gây phân mảnh DNA trên dòng tế bào MCF-7 không có sự biểu hiện của caspase-3 [25].
Một trong những cơ chất của caspase-6 là lamin, sự phân cắt lamin có thể làm cô đặc nhiễm sắc chất [24]. Nghiên cứu của Toshinori Okinaga (2007) chứng minh caspase-6 đóng vai trò quyết định trong sự phân cắt lamin A/C và caspase-7 cũng có khả năng phân cắt PARP trong quá trình apoptosis của đại thực bào bị nhiễm
khuẩn[52]. Sự phân mảnh của nhân xảy ra là do caspase-6 phân cắt lamin A [65] Như vậy, có thể thấy ngoài caspase-3 thì vẫn còn có những yếu tố khác có thể hoạt hóa apoptosis dẫn đến những sự thay đổi về hình thái đặc trưng của tế bào apoptosis và kết quả cuối cùng là tế bào bị chết theo chương trình.
Từ các kết quả thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những kết luận sau:
Ở nồng độ 100 µg/ml, so với các cao chiết đem thử nghiệm trên ba dòng tế bào ung thư, cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) thể hiện khả năng gây độc tế bào cao nhất trên dòng tế bào ung thư cổ tử
cung HeLa, với giá trị IC
50
là 92,6 ± 9,74 (µg/ml).
Cao chiết phân đoạn n-BuOH và nhất là cao chiết phân đoạn diethyl ete chiết xuất từ nấm Linh chi vàng rất có tiềm năng gây độc mạnh trên dòng tế bào HeLa. Khả năng gây độc tế bào HeLa của cao chiết phân đoạn diethyl ete tương đương với cao chiết cồn. Trong khi đó, polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng thể hiện độc tính thấp trên các dòng ung thư thử nghiệm.
Ở nồng độ 92,6 µg/ml, cao chiết cồn nấm Linh chi vàng có khả năng gây apoptosis đối với tế bào HeLa, thể hiện qua :
• Sự thay đổi hình thái tế bào đặc trưng của quá trình apoptosis dưới sự quan sát của kính hiển vi huỳnh quang
• Sự xuất hiện thang DNA ở thời điểm sau 48 giờ cảm ứng với cao chiết
Tuy nhiên, con đường gây apoptosis của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng không thông qua hoạt động của caspase-3.
Việc chúng tôi đề xuất khả năng gây độc và cảm ứng apoptosis của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào ung thư HeLa có thể là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo, nhằm phát triển loại cao chiết có tiềm năng này trong tương lai trở thành một loại thuốc chữa bệnh phổ biến trên thị trường.
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Thị Bằng, Đàm Nhận, Nguyễn Kim Bích và cs (2006). Nghiên cứu xác định tên khoa học, dấu vân tay hóa học và tác dụng sinh học của một số loài nấm đa niên thuộc chi Ganoderma và chi Phellinus. Trích trong: Nghiên cứu phát triển dược liệu và đông dược Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 331-343.
2. Bùi Thị Bằng và cộng sự (2006).Kết quả nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh học của nấm Vân chi Trametes versicolor. Trích trong Nghiên cứu phát triển dược liệu và đông dược Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học Và Kỹ Thuật, Hà Nội. tr 364-374.
3. Bùi Thị Bằng, Nguyễn Chiến Binh, Nguyễn Bá Hoạt và cs (2007). Tác dụng của nấm Vân chi (Trametes versicolor (L.) FR.PILAT.) trên một số dòng tế bào ung thư trên thực nghiệm in vitro và in vivo. Tài liệu Hội nghị Dược liệu toàn quốc lần thứ hai “Phát triển Dược liệu đến năm 2015 và tầm nhìn 2020”. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 186-192.
4. Nguyễn Gia Chấn, Đàm Nhận, Lê Xuân Thám (2001). Thăm dò khả năng đào thải phóng xạ Cs-134 bằng cao nấm Linh chi ở chuột nhắt trắng. Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000- Viện Dược Liệu. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 347-351.
5. Hồ Huỳnh Thùy Dương. (2007).Xây dựng và hoàn chỉnh các quy trình dùng trong sàng lọc tính kháng phân bào của cây thuốc ở mức tế bào và phân tử.
Chương trình nghiên cứu cơ bản. Sở khoa học và công nghệ TP. Hồ Chí Minh.
6. Đỗ Khắc Hiếu, Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương (2004). Tác dụng của chất chiết từ nấm Linh chi, cây Lưỡi rắn, cây Trinh nữ hoàng cung, lên các dòng tế bào ung thư. Hội nghị toàn quốc 2004 Nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống- định hướng y dược học, tr 224-226.
7. Cổ Đức Trọng (2008). Hướng dẫn chọn dùng Linh chi trong phòng chữa bệnh. Nhà xuất bản Trẻ,Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Lê Xuân Thám, Trần Hữu Độ (1999). Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm Vân Chi Trametes versicolor (L.:FR.) Pilát. Tạp chí dược học
(2).
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
9. Ajith, T.A. and Janardhanan, K.K. (2007). Indian Medicinal Mushrooms as a Source of Antioxidant and Antitumor Agents. J Clin Biochem Nutr. 40(3), 157–162.
10. Alison, M.R. (2003). The cancer handbook. United Kingdom.
11. Boehringer Mannheim (1998). Apoptosis and cell proliferation 2nd edition. Germany.
12. Brady, H.M. Apoptosis methods and protocols. Methods in molecular biology
(282)
13. Calvin˜ o, E., Manjón, J.L., Sancho , P., Tejedor , M.C., Herráez , A., Diez, J.C. (2010). Ganoderma lucidum induced apoptosis in NB4 human leukemia cells: Involvement of Akt and Erk. Journal of Ethnopharmacology (128), 71-78.
14. Candé, C., Cecconi, F., Dessen, P., Kroemer, G. (2002). Apoptosis-inducing factor (AIF) : key to the conserved caspase-independent pathways of cell death ? Journal of cell science (115), 4727-4734.
15. Cao, L.Z., Lin, Z.B. (2003). Regulatory effect of Ganoderma lucidum
polysaccharides oncytotoxic T-lymphocytes induced by dendritic cells in vitro.
Cao LZ et al / Acta Pharmacol Sin 24 (4), 312-326.
(2008). Ganoderma lucidum polysaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immuno-stimulatory function. Journal of Hematology & Oncology (1), 9.
17. Collins, J.A., Schandl, C.A., Young, K.K., Vesely, J. and Willingham, M.C. (1997). Major DNA fragmentation is a late event in apoptosis. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45(7), 923–934.
18.
Collins, L., Zhu, T., Guo, J., Xiao, Z.J., and Chen, C.Y. (2006). Phellinus
linteus sensitises apoptosis induced by doxorubicin in prostate cancer. British Journal of Cancer ( 95), 282-288.
19. Cui, J., Chisti, Y. (2003). Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses, and production. Biotechnology Advances (21), 109 – 122.
20. Elmore, S. (2007). Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.Toxicol Pathol 35(4), 495–516.
21. El Dine, R.S., El Halawany, A.M., Ma, C.M., and Hattori, M. (2008). Anti- HIV-1 protease activity of lanostane triterpenes from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod. (71), 1022-1026.
22. El Dine R.S., El Halawayny A.M., Nakamura, N., Ma, C.M., Hattori M. (2008). New lanostane triterpene lactones from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum (FR.)C.F.BAKER. Chem. Pharm. Bull., 56(5), 642-646. 23. El Dine, R.S., El Halawany, A.M., Ma, C.M., and Hattori, M. (2009).
Inhibition of the dimerization and active site of HIV-1 protease by secondary metabolites from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod. (72), 2019-2023.
24. Fan, T.J., Han, L.H., Cong, R.S. and Liang, J. (2005). Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 37(11), 719— 727.
Zisterer, D.M. ( 2002). Caspase-3 is not essential for DNA fragmentation in MCF-7 cells during apoptosis induced by the pyrrolo-1,5-benzoxazepine, PBOX-6. Elsevier Science B.V. Europe.
26. Gerl, R. and Vaux, D.L. (2005). Apoptosis in the development and treatment of cancer. Carcinogenesis 26(2), 263-270.
27. Guo, J. Zhu, T. Collins, L. Xiao, Z.X.J., Kim, S.H., and Chen, C,Y. (2007). Modulation of lung cancer growth arrest and apoptosis by
Phellinus linteus. Molecular Carcinogenesis (46),144 – 154.
28. Hajjaj, H., Macé, C., Roberts, M., Niederberger, P., and Fay, L.B. (2005). Effect of 26-oxygenosterols from Ganoderma lucidum and their activity as cholesterol synthesis inhibitors. Appl Environ Microbiol. 71(7), 3653–3658. 29. Hanahan, D. and Weinberg, R.A., (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100,
57-70.
30. Han, S.B., Lee, C.W., Jeon Y.J., Hong, N.D., Yoo, I.D., Yang, K.H, Kim, H.M. (1999). The inhibitory effect of polysaccharides isolated from Phellinus linteus on tumor growth and metastasis. Immunopharmacology (41), 157-164.
31. Han, S.B., Lee, C.W., Kang, J.S., Yoon, Y.D., Lee, K.H., Lee, K., Park, S.K., Kim, H.M. (2006). Acidic polysaccharide from Phellinus linteus inhibits melanoma cell metastasis by blocking cell adhesion and invasion. International Immunopharmacology 6, 697 – 702.
32. Hao, L.L., Mei, Q.b., Zhang, B.l., Jia, M., Li, X.Q., Zhang, F. (2004). PC-407 inhibited proliferation and induced apoptosis
in human colon cancer SW-1116 cells. Hao LL et al/ Acta Pharmacol Sin 25(11), 1509-1514.
33. Ho, C.Y., Kim, C.F., Leung, K.N., Fung, K.P., Tse, T.F., Chan, H., and Lau, C.B.S. (2005). Differential anti-tumor activity Coriolus versicolor (Yunzhi) extract through p53- and/or Bcl-2-dependent apoptosis pathway in human
breast cancer cells. Cancer Biol Ter 4 (6).
34. Hong, K.J., Dunn, D.M., Shen, C.L., Pence, B.C. Effects of Ganoderma lucidum on apoptotic and anti-inflammatory function in HT-29 human colonic carcinoma cells. Phytother. Res. (18), 768-770.
35. Houghton, P., Fang, R., Techatanawat, I., Steventon, G., Hylands, P.J., Lee, C.C. (2007). The sulphorhodamine (SRB) assay and other approaches to testing plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer activity. Methods (42), 377-387.
36. Hu, H., Ahn, N.S., Yang, X., Lee, Y.S., Kang, K.S. (2002). Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. Int. J. Cancer 102, 250–253.
37. Hua, Z.J., Xu, M. (2000). DNA fracmentation in apoptosis. Cell reseach (10), 205-211.
38. Jiang, J., Slivova, V., And Sliva, D. (2006). Ganoderma lucidum inhibits proliferation of human breast cancer cells by down-regulation of estrogen receptor and NF-κB signaling. International journal of oncology (29), 695-703.
39. Jiménez-Medina, E., Berruguilla, E., Romero, I., Algarra, I., Collado, A., Garrido, F. and Garcia-Lora, A. (2008). The immunomodulator PSK induces in vitro cytotoxic activity in tumour cell lines via arrest of cell cycle and induction of apoptosis. BMC Cancer (8), 78.
40. Kim, G.Y., Lee, J.Y., Lee, J.O., Ryu C.H., Choi, B.T., Jeong,Y.K., Lee, K.W., Jeong, S.C., and Choi, Y.H. (2006). Partial characterization and immunostimulatory effect of a novel polysaccharide-protein complex extracted from Phellinus linteus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(5), 1218-1226.
41. Kim, H.G., Yoon, D.H., Lee, W.H., Han, S.K., Shrestha, B., Kim, C.H., Lim, M.H., Chang, W., Lim, S., Choi, S., Song, W.O., Sung, J.M., Hwang, K.C., Kim, T.W. (2007). Phellinus linteus inhibits inflammatory
mediators by suppressing redox-based NF-κB and MAPKs activation in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophage. Journal of Ethnopharmacology (114), 307-315.
42. Kleinwa¨chter, P., Ngo Anh, Trinh Tam Kiet, Schlegel, B., Dahse, H.M., Ha¨ rtl, A., and Gra¨fe, U. (2001). Colossolactones, new triterpenoid metabolites from a Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod. (64), 236- 239.
43. Kojima, K., Ohno, T., Inoue, M., Mizukami, H., Nagatsu, A. (2008). Phellifuropyranone A: A new furopyranone compound isolated from fruit bodies of wild Phellinus linteus. Chem. Pharm. Bull 56(2), 247- 255.
44. Lau, C.B.S., Ho, C.Y., Kim, C.F., Leung, K.N., Fung, K.P., Tse, T.F., Chan, H.H.L., and Chow, M.S.S. (2004), Cytotoxic activities of Coriolus versicolor
(Yunzhi) extract on human leukemia and lymphoma cells by induction of apoptosis. Life Sciences 75, 797–808.
45. Li, L.Y., Luo, X., Wang, X. (2001). Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature (412), 95-99.
46. Li, G., Kim, D.H., Kim, T.D., Park, B.J., Park, H.D., Park, J.I., Na, M.K., Kim, H.C., Hong, N.D., Lim, K., Hwang, B.D., Yoo, W.H. (2004). Protein- bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480 human colon cancer cells. Cancer letters
(216), 175-181.
47. Liu, R.M., Zhong, J.J. (2011). Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells. Phytomedicine (18), 349-355.
48. Loo, G.v., Schotte, P., Gurp, M .v., Demol, H., Hoorelbeke, B., Gevaert, K., Rodriguez, I., Carrillo, A.R., Vandekerckhove, J., Declercq, W., Beyaert, R., and Vandenabeele, P. (2001). Endonuclease G: a mitochondrial protein released
in apoptosis and involved I caspase-independent DNA degradation. Cell Death and Differentiation (8), 1136-1142.
49. Matsuba, S., Matsuno, H., Sakuma, M., Komatsu, Y. (2008). Phellinus linteus
extract augments the immune response in mitomycin C - induced immunodeficient mice. eCAM 5(1), 85 – 90.
50. Medina, E.J., Berruguilla, E., Romero, I., Algarra, I., Collado, A., Garrido, F., and –Lora, A.G. (2008). The immunomodulator PSK induces in vitro cytotoxic activity in tumour cell lines via arrest of cell cycle and induction of apoptosis.