Kính hiển vi huỳnh quang cho phép phát hiện được tế bào apoptosis ở các giai đoạn sớm hoặc muộn của quá trình apoptosis. Đặc biệt, phương pháp này còn giúp phân biệt giữa apoptosis và necrosis.
Acridine orange (AO) và ethidium bromide (EB) đều là những thuốc nhuộm nhân và gắn chèn vào giữa các base thuộc phân tử DNA. AO có khả năng thấm qua màng của cả tế bào sống và tế bào chết. Nếu AO gắn xen vào giữa mạch đôi của phân tử DNA, sẽ quan sát được ánh sáng màu xanh dưới kính hiển vi huỳnh quang; EB chỉ có thể thấm qua màng của tế bào chết và thường phát ra ánh sáng màu đỏ khi gắn vào DNA [55].
Vì AO không thể phân biệt được giữa tế bào sống và chết nên phải phối hợp AO với EB, đặc tính thấm qua màng khác nhau giữa hai loại thuốc nhuộm này sẽ giúp phân biệt tế bào sống và tế bào chết.
* Thử nghiệm được tiến hành như sau:
- Tế bào được cho vào các đĩa nhựa nuôi cấy đường kính 35 mm đạt mật độ 105 tế bào/đĩa.
- Ủ tế bào trong tủ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
- Cảm ứng tế bào với mẫu dịch chiết nấm ở nồng độ IC50, mẫu chứng dương Camptothecin ở nồng độ 0,01 µg/ml và mẫu chứng DMSO ở nồng độ 0,25%.
- Sau các khoảng thời gian cảm ứng thích hợp, hút cẩn thận bỏ hết dịch nổi trong đĩa. Rửa đĩa bằng 1 ml PBS, dùng giấy thấm khô PBS thừa trong đĩa.
- Thêm 25 µl dung dịch nhuộm AO/EB vào đĩa (thuốc nhuộm kép AO/EB được pha trong PBS theo tỷ lệ 100µg/ml AO:100µg/ml EB và thường được pha ngay trước khi cần dùng), đảo nhẹ cho thuốc nhuộm lan đều khắp đĩa. Dùng giấy thấm khô thuốc nhuộm thừa trong đĩa.
- Đặt lamelle lên và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.