Sử dụng bộ kit (EnzChek®Caspase-3Assay Kit 2, Invitrogene) để xác định hoạt tính của caspase-3.
Nguyên tắc: xác định hoạt tính protease của caspase-3 đặc hiệu trên cơ chất
DEVD (Asp-Glu-Val-Asp). Cơ chất chính của bộ kit là Rhodamine 110 bis-(N- CBZ-L-aspartyl-Lglutamyl-L-valyl-Laspartic acid amide) (Z-DEVD–R110). Khi có sự hiện diện của caspase-3, cơ chất (không phát huỳnh quang) bị phân cắt thành sản
phẩm phát huỳnh quang (bước sóng kích thích 496 nm, bước sóng phát ra 520 nm). Như vậy hoạt tính caspase tỉ lệ thuận với lượng huỳnh quang đo được ở 520 nm.
* Thử nghiệm được tiến hành như sau:
- Tế bào HeLa được nuôi cấy trong bình Roux 25 cm2 với mật độ ban đầu 7,5.105 tế bào/ bình; kiểm tra độ phủ và hình thái tế bào sau hai ngày nuôi cấy.
- Cảm ứng tế bào với cao chiết ở nồng độ IC50, với chứng âm tế bào không được cảm ứng cao chiết, chứng dương tế bào được cảm ứng với Camptothecin ở nồng độ 0,01 μg/ml.
- Sau các thời gian cảm ứng thích hợp, xác định tỉ lệ sống chết của tế bào bằng phương pháp Trypan Blue.
- Tiến hành thử nghiệm caspase: ly giải tế bào bằng dịch ly giải lạnh (EnzChek®Caspase-3Assay Kit 2, Invitrogene), đặt trên đá trong 3 phút, sau đó chuyển sang bồn nước ổn nhiệt 370oC trong 3 phút, lặp lại 4 lần; thu nhận dịch ly giải tế bào và dùng 5 μl dịch ly giải tế bào để định lượng protein bằng thử nghiệm Bradford.
- Định lượng protein bằng thử nghiệm Bradford: dựng đường chuẩn BSA cho định lượng protein.
Pha loãng dung dịch mẹ BSA 2mg/ml trong PBS (-) thành các nồng độ theo bảng sau:
Nồng độ BSA (μg/ml) 0 25 50 75 100 125 150
BSA 2mg/ml (μl) 0 12,5 25 37,5 50 62,5 75
PBS (μl) 1000 987,5 975 962,5 950 937,5 925
Pha loãng mẫu cần xác định lượng protein tổng (thường pha loãng 100 lần). Cho 160 μl dung dịch Bradford 1X vào giếng, cho 40 μl mẫu/giếng. Lắc 3 phút, đo mật độ quang ở 595 nm. Tính nồng độ protein dựa trên đường chuẩn BSA.
Pha loãng để có được 50 μl dịch ly giải chứa 200μg protein tổng rồi chuyển vào mỗi giếng/đĩa 96 giếng chuẩn bị cho phản ứng đo hoạt tính caspase-3.
- Thiết kế những phản ứng đo hoạt tính caspase-3 gồm: 1 chứng dương hoạt tính caspase-3 (mẫu ly giải protein của tế bào cảm ứng với Camptothecin); các mẫu ly giải (từ tế bào) và các mẫu blank (không có tế bào chỉ có dịch ly giải).
- Chuẩn bị dung dịch cơ chất cho phản ứng 2X: 10μl Z-DEVD-R110 5mM + 990μl 2X Buffer phản ứng.
- Phản ứng: thêm 50μl dung dịch cơ chất 2X vào các mẫu (đã chuẩn bị sẵn ở phần trên), sau đó ủ mẫu ở 370oC. Đo tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng kích thích 496nm, bước sóng phát ra 520nm trong 30 và 90 phút.
Công thức tính tỉ lệ thay đổi hoạt động của caspase-3:
Tỉ lệ thay đổi hoạt tính caspase-3 (lần) = OD TN /OD C Trong đó: TN: thực nghiệm C: chứng
Xử lý số liệu: Thử nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS version 11.5, độ tin cậy 95%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng gây độc tế bào in vitro của các cao chiết thô (cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các loại nấm Linh chi, Vân chi và Thượng hoàng bằng thử nghiệm SRB. Ba dòng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu là tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460. Sau khi đã xác định được cao chiết thô tiềm năng, chúng tôi tiếp tục sử dụng thử nghiệm SRB để khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro của các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ loại nấm của cao chiết thô tiềm năng trên để sơ bộ định hướng nhóm hoạt chất.
Sau khi so sánh khả năng gây độc trên ba dòng tế bào ung thư Hela, MCF-7 và NCI-H460 của cao chiết thô tiềm năng với các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô, chúng tôi đã chọn ra được cao chiết có khả năng gây độc tế bào tốt nhất và tiến hành khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis của nó. Một loạt các thử nghiệm như: quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm AO/EB, phân tích sự phân mảnh của DNA và khảo sát hoạt động của caspase-3 được thực hiện để xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết trên.
3.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết thô (cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7
Chúng tôi ứng dụng quy trình SRB đã được khảo sát và chuẩn hóa bởi phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - bộ môn Di truyền - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh để sàng lọc hoạt tính gây độc của các cao chiết cồn và các cao chiết nước chiết xuất từ 7 loại nấm dược liệu được nuôi trồng tại Việt Nam trên 3 dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7.
Chúng tôi chọn nồng độ 100 µg/ml làm nồng độ sàng lọc. Để đánh giá sơ bộ về khả năng gây độc tế bào của các cao chiết, chúng tôi cảm ứng ba dòng tế bào Hela, MCF-7 và NCI-H460 với các cao chiết ở nồng độ 100 µg/ml với thời gian cảm ứng là 48 giờ. Chứng dương được sử dụng trong thử nghiệm là Camptothecin nồng độ 0,01µg/ml.