Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Tryphan blue để nhuộm tế bào nhằm phân biệt tế bào sống và tế bào chết, quan sát trong buồng đếm hồng cầu. Tryphan blue là thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có khả năng đi xuyên qua màng tế bào đã mất tính bán thấm. Do đó, khi dịch huyền phù tế bào được hòa trộn chung với Tryphan blue, những tế bào sống có màng còn nguyên vẹn không hấp thụ được Tryphan blue nên tế bào sẽ có hình dạng tròn, sáng và không bắt màu xanh. Ngược lại, những tế bào chết màng bị hư tổn, sẽ hấp thu thuốc nhuộm và có màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi ( xem hình 2.3).
Hình 2.3. Tế bào nhuộm với Tryphan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu * Thử nghiệm được tiến hành như sau:
• Lau sạch bề mặt buồng đếm hồng cầu và lamelle với cồn 70%. Phải đảm bảo buồng đếm sạch, khô, không dính vết, dấu tay hoặc nước. Đặt lamelle bao phủ toàn bộ bề mặt vùng đếm của buồng đếm.
• Pha loãng dịch huyền phù tế bào (thu từ bước huyền phù tế bào trong cấy chuyền) 2 lần với Tryphan blue bằng cách trộn 25 µl dịch huyền phù tế bào với 25 µl Tryphan blue 0,4%.
C
h ú ý : khi sử dụng buồng đếm hồng cầu, lượng tế bào tối đa cho 1mm2 ô đếm là 50-100 tế bào. Pha loãng tế bào nếu cần thiết để thu được dịch huyền phù tế bào đồng nhất.
• Chuyển dịch tế bào đã huyền phù trong Tryphan blue vào cạnh buồng đếm, bơm nhẹ, dịch tế bào sẽ tự dàn đều trên bề mặt buồng đếm dưới lamelle phủ nhờ lực mao dẫn.
• Quan sát tế bào dưới kính hiển vi, vật kính 10X.
• Đếm tế bào ở 4 ô ở góc (A, B, C, D) và ô trung tâm (E) trong buồng đếm hồng cầu (xem hình 2.4). Mỗi ô lớn này được chia làm 16 ô nhỏ hơn. Tế bào trong các vùng đếm này nên được phân bố đều, không đóng cục. Nếu tế bào không phân bố đều, rửa buồng đếm và làm lại. Các tế bào sống sẽ sáng rõ (không được nhuộm), các tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh.
C
h ú ý : đếm các tế bào ở bên trong, chạm giữa đường kẻ trên và bên trái hình vuông. Không đếm những tế bào chạm giữa đường kẻ ở dưới và bên phải hình vuông.
- Cách tính :
¾ Mật độ tế bào trong mẫu được tính như sau :
N = (n/5) x 10
4
x a
¾ Tỷ lệ tế bào chết trong mẫu được tính như sau :
% d = (d/n) x 100
Trong đó :
N : mật độ tế bào có trong mẫu
d : tổng số tế bào chết có trong buồng đếm n : tổng số tế bào có trong buồng đếm a : hệ số pha loãng
104 : thể tích buồng đếm
2.2.4.Thử nghiệm SRB
Sulforhodamine B (SRB) là một thuốc nhuộm aminoxanthene màu hồng sáng. Ở môi trường acid yếu, thuốc nhuộm SRB liên kết tĩnh điện với các amino acid kiềm của protein tế bào, và ở môi trường kiềm yếu thì SRB sẽ tách ra khỏi liên kết và hòa tan.
Thử nghiệm SRB là phương pháp đo lường hàm lượng protein tế bào, được Skehan và các cộng sự công bố vào 1990. Thử nghiệm dựa vào khả năng liên kết giữa thuốc nhuộm SRB với protein của các tế bào đã được cố định vào đĩa nuôi cấy bằng trichloriacetic acid (TCA). Phần thuốc nhuộm liên kết với protein tế bào sẽ
được hòa tan trong môi trường kiềm yếu và thông qua thiết bị đo màu sẽ đánh giá được tổng lượng protein. Tổng lượng thuốc nhuộm phân tách từ các tế bào đã được nhuộm sẽ tương ứng với tổng lượng protein của tế bào. Thử nghiệm SRB cho thấy hàm lượng protein tế bào tuyến tính với mật độ tế bào.
Có thể nói, đây là phương pháp so màu đơn giản và nhạy được sử dụng để xác định mật độ tế bào thông qua tổng lượng protein của tế bào, từ đó phản ánh hoạt tính gây độc tế bào in vitro của chất thử nghiệm [60].
* Thử nghiệm được tiến hành như sau:
Bước 1: Thiết kế đĩa 96 giếng
- Với mỗi mẫu cao chiết và tại mỗi nồng độ thử nghiệm, cần có 2 giếng không có tế
bào (giếng blank) và 2 giếng có tế bào.
C
h ú ý : thiết kế sao cho 2 giếng tế bào ở giữa, còn 2 giếng blank ở hai bên và ở rìa của đĩa 96 giếng.
- Thí nghiệm được thiết kế gồm các cao chiết ở nồng độ khảo sát, chứng dương là
Camptothecin nồng độ 0,01µg/ml, chứng âm là môi trường nuôi cấy E’MEM. Ngoài ra, còn có hai mẫu chứng là môi trường chứa 0,5% nước cất hai lần đã hấp khử trùng và môi trường chứa DMSO nồng độ 0,25%.
Bước 2: Phủ tế bào vào đĩa 96 giếng
a. Thế hệ tế bào dùng cho thử nghiệm là từ P4-P20.
b. Chọn những bình Roux chứa tế bào đạt độ phủ khoảng 70-80%. Kiểm tra sự
nhiễm khuẩn nấm, trạng thái tế bào của các bình này.
c. Tách tế bào bằng phương pháp trypsin (xem phần 2.2.2). d. Thu nhận dịch huyền phù tế bào đơn.
e. Đếm tế bào bằng phương pháp Tryphan blue (xem phần 2.2.3) để xác định mật
độ tế bào của dịch huyền phù tế bào đơn.
f. Tính toán mật độ tế bào cần phủ. Đối với dòng tế bào Hela và MCF-7, mật độ tế
bào cần để phủ vào giếng là 104 tế bào/giếng. Riêng đối với dòng NCI-H460 là 7,5x103 tế bào/giếng.
g. Cho 100 µl dịch tế bào đồng nhất ở mật độ cần vào mỗi giếng trên đĩa theo thiết
kế. Để tế bào chảy dọc nhẹ nhàng từ thành giếng xuống đáy giếng.
h. Kiểm tra đĩa tế bào vừa phủ dưới kính hiển vi về hình thái và lượng tế bào huyền
phù trong mỗi giếng.
i. Nhẹ nhàng chuyển đĩa tế bào vào tủ 37oC, 5% CO
2
. Ủ trong 24 giờ.
Bước 3: Ủ tế bào với dịch chiết cần thử nghiệm
Pha loãng dịch chiết
- Dùng môi trường nuôi cấy E’MEM 10% FBS để pha loãng dịch chiết mẹ (40.000 µg/ml) của các mẫu cao chiết thành những nồng độ cần thử nghiệm. Sau đó, lọc qua phin lọc vô trùng 0,22 µm.
- Pha các mẫu chứng theo các nồng độ đã thiết kế.
C
h ú ý : nếu nồng độ cần thử nghiệm là 1X, thì nồng độ pha và cho vào giếng là 2X. - Vortex nhẹ trước khi thêm vào giếng (100 µl/giếng). Cho dịch chiết chảy nhẹ nhàng dọc từ thành xuống đáy giếng, không cho quá nhanh và mạnh sẽ làm khuấy động tế bào trong giếng.
- Ủ đĩa trong tủ 37oC, 5% CO
2
trong 48 giờ.
Bước 4: Cố định tế bào
- Trước khi cố định tế bào, quan sát và ghi nhận hình thái tế bào sau 48 giờ ủ với
dịch chiết.
- Bổ sung 50 µl TCA lạnh 50% vào mỗi giếng. Không nên cho TCA vào giếng quá mạnh sẽ làm tróc tế bào dưới đáy giếng.
- Ủ đĩa trong tủ 4oC trong 1 giờ.
- Loại bỏ nhanh toàn bộ phần chất lỏng trong mỗi giếng.
- Rửa giếng 5 lần với nước cất 1 lần (200 µl/giếng), áp mặt giếng lên giấy thấm cho khô sau khi rửa.
- Để đĩa khô tại nhiệt độ phòng khoảng 12-24 giờ.
Bước 5: Nhuộm SRB
- Bổ sung 100 µl dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng cần nhuộm.
- Loại bỏ toàn bộ lượng thuốc nhuộm.
- Rửa các giếng 5 lần bằng dung dịch acid acetic 1% (200 µl/giếng). - Dùng giấy thấm loại bỏ acid acetic thừa còn bám ở miệng giếng. - Để đĩa khô tại nhiệt độ phòng khoảng 12-24 giờ.
Bước 6: Đọc kết quả
- Bổ sung 100 µl dung dịch Tris-base 10 mM vào mỗi giếng.
- Lắc đĩa trên máy đọc ELISA cho đến khi tất cả các SRB gắn protein hòa tan hoàn
toàn trong Tris-base, khoảng 15 phút.
- Đọc trên máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm và 620 nm.
Bước 7 : Phân tích số liệu
Xác định tỷ lệ (%) gây độc tế bào
- Giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm (OD492) và 620 nm (OD620) được thu nhận qua máy đọc ELISA. Các số liệu được xử lý trong Excel để tính tỷ lệ (%) gây độc tế bào .
- Tỷ lệ gây độc tế bào được tính theo công thức :
% I = (1- OD TN /OD C ) x 100% Trong đó
É ODTN : là giá trị OD của mẫu dịch chiết É OD
C
: là giá trị OD của mẫu chứng (DMSO, nước) Giá trị ODTN và ODC được tính theo công thức chung
É OD = OD’tế bào - OD’blank É OD’= OD492 – OD620
- Giá trị STD được tính bằng hàm STDEV trong Excel. Xác định giá trị IC50
- Xây dựng đồ thị tương quan giữa tỷ lệ gây độc tế bào với các nồng độ dịch chiết khác nhau.
Xử lý thống kê
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS version 11.5, độ tin cậy 95%.