Đầu tiên, chúng tôi khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis của cao chiết cồn Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa bằng phương pháp nhuộm tế bào với thuốc nhuộm kép AO/EB phát huỳnh quang. Dưới tác dụng của thuốc nhuộm kép AO/EB, kính hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát sự thay đổi hình thái đặc trưng của tế bào trong suốt quá trình apoptosis.
Quần thể tế bào ung thư HeLa được cảm ứng với cao cồn Linh chi vàng ở nồng độ IC50 (92,6 µg/ml). Chúng tôi chọn thời điểm để khảo sát là 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Sau mỗi thời điểm khảo sát, chúng tôi thu nhận kết quả và trình bày trong hình 3.10.
Ở thời điểm 24 giờ, quan sát quần thể tế bào HeLa đối chứng (không xử lý với cao chiết), chúng tôi thấy các tế bào bám trải đều trên giá thể, quần thể tế bào có màu xanh sáng đều (hình 3.10.A), cho thấy đây là quần thể tế bào sống. Vì màng của tế bào sống còn nguyên vẹn, không bị tổn thương nên chỉ cho thuốc nhuộm AO đi vào, làm cho tế bào phát màu của thuốc nhuộm có màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đồng thời tế bào có màu xanh sáng đều là do không có hiện tượng cô đặc nhiễm sắc chất. Trong khi đó, ở quần thể tế bào HeLa xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml, sau 24 giờ cảm ứng chúng tôi
nhận thấy nhiễm sắc chất cô đặc lại và phát huỳnh quang xanh (vùng phát ánh sáng mạnh trên hình 3.10.B). Lúc này màng tế bào vẫn còn nguyên vẹn nên chỉ cho AO đi vào, vì thế nên phát ra huỳnh quang xanh. Rải rác ở một vài tế bào trong quần thể có hiện tượng “blebbing” trên màng tế bào. Hiện tượng này không thấy xảy ra ở quần thể tế bào đối chứng. Điều này chứng tỏ quần thể tế bào HeLa cảm ứng với cao chiết cồn bắt đầu có hiện tượng apoptosis sau 24 giờ cảm ứng. Hiện tượng tế bào tròn lại và “blebbing” là những đặc điểm dễ nhận biết nhất khi tế bào bắt đầu quá trình apoptosis [67].
Quan sát trên hình 3.10, tế bào trong các quần thể đối chứng (hình A, C và E) tăng trưởng một cách tự nhiên phù hợp với quy luật phát triển của một quần thể tế bào trong môi trường nuôi cấy, số lượng tế bào đối chứng tăng lên dần cho đến thời điểm 48 giờ. Ngược lại, ở các quần thể tế bào xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng (hình B, D và F) thì mật độ tế bào càng lúc càng giảm so với quần thể chứng theo thời gian nuôi cấy, cho thấy tế bào trong quần thể cảm ứng với cao cồn có sự ngừng tăng trưởng.
Ở quần thể tế bào HeLa xử lý với cao chiết cồn sau 36 giờ (hình D), hiện tượng “blebbing” xảy ra nhiều hơn so với thời điểm 24 giờ. Ở quần thể xử lý với cao chiết cồn sau 36 và 48 giờ (hình D và F), không thấy sự xuất hiện của nhân con mà thay vào đó là những điểm sáng rất nhỏ (nhỏ hơn nhân con), bắt sáng mạnh, dàn trải đều trong nhân, đó là do nhiễm sắc chất cô đặc bị phân cắt. Trong khi đó, trên quần thể tế bào đối chứng ở 36 và 48 giờ (hình C và D), ta vẫn quan sát thấy rất rõ sự có mặt của các nhân con trong tế bào.
Vào thời điểm 48 giờ, thấy có sự xuất hiện của thể apoptotic ở giai đoạn apoptosis muộn. Lúc này màng của thể apoptotic ở giai đoạn muộn đã bị tổn thương nên cho cả 2 loại thuốc nhuộm AO và EB đi vào, nhưng do EB phát quang mạnh hơn nên sẽ nhìn thấy có màu vàng cam, đồng thời nhiễm sắc chất cô đặc nên phát màu vàng cam sáng (hình F).
Hình 3.10. Hình thái tế bào HeLa quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. A, C và E – quần thể tế bào không cảm ứng với cao chiết cồn sau 24, 36 và 48 giờ. B, D và F – quần thể tế bào cảm ứng với cao chiết cồn ở nồng độ 92,6 µg/ml sau 24, 36
Như vậy, khi quan sát quần thể tế bào HeLa cảm ứng với cao chiết cồn ở nồng độ 92,6 µg/ml dưới kính hiển vi huỳnh quang, sự biến đổi hình thái tế bào mà chúng tôi quan sát được phù hợp với những biến đổi về hình thái của tế bào apoptosis trong những nghiên cứu trước đây [32],[56]. Vì thế, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào HeLa của cao chiết cồn Linh chi vàng bằng phương pháp phân tích DNA phân mảnh.