Dựa vào sự thay đổi hình thái của tế bào HeLa trong quá trình apoptosis (mục 3.4.1), chúng tôi nhận thấy ở thời điểm 24 và 36 giờ, số lượng tế bào bị apoptosis vẫn chưa nhiều và đa phần các tế bào vẫn còn ở giai đoạn sớm của apoptosis so với thời điểm 48 giờ. Nếu ở giai đoạn sớm, thì DNA chỉ mới bị phân cắt thành những mảnh lớn, khi chạy điện di trên gel agarose không thể tạo được thang DNA. Vì thế, chúng tôi quyết định chọn thời điểm tối thiểu là 48 giờ để khảo sát hiện tượng phân mảnh DNA.
Nghiên cứu trước đây chứng minh Camptothecin (CPT) ở nồng độ 0,01 µg/ml có thể gây nên sự phân cắt đặc hiệu DNA bộ gen ở dòng tế bào ung thư HeLa [5]. Dựa trên kết quả này, chúng tôi sử dụng CPT làm chứng dương để kiểm tra hiệu quả và tính ổn định của quy trình phát hiện DNA phân mảnh trên dòng tế bào HeLa, với nồng độ sử dụng là 0,01 μg/ml. Sau thời gian cảm ứng là 48 giờ, chúng tôi thu nhận lấy DNA của quần thể tế bào xử lý với CPT.
Chúng tôi cảm ứng tế bào HeLa với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ IC50 = 92,6 µg/ml. Đối chứng là quần thể tế bào không xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng. Sau các khoảng thời gian cảm ứng là 48 giờ và 72 giờ, chúng tôi thu nhận DNA từ các mẫu đối chứng và mẫu xử lý với cao chiết cồn. Kết quả chạy điện di DNA trên gel agarose được thể hiện ở hình 3.11.
M – thang 100bp
1 – mẫu đối chứng sau 48giờ
2 – mẫu xử lý với cao chiết sau 48 giờ
3 – mẫu đối chứng sau 72 giờ
4 – mẫu xử lý với cao chiết sau 72 giờ
5 – mẫu tế bào xử lý với CPT sau 48 giờ (chứng dương) 1000bp 900bp 800bp 700bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp M 1 2 3 4 5
Hình 3.11. Kết quả điện di DNA bộ gen của quần thể tế bào HeLa sau khi được cảm ứng với cao chiết cồn
Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml.
Kết quả chạy điện di DNA ở hình 3.11 cho thấy, mẫu tế bào đối chứng không xử lý với cao chiết cồn sau 48 giờ không biểu hiện sự phân mảnh của DNA (giếng 1). Ngược lại, ở mẫu tế bào xử lý với cao chiết cồn sau 48 giờ thì thấy có sự phân mảnh DNA với sự xuất hiện của thang DNA (giếng 2). Ở mẫu chứng dương cảm ứng với CPT sau 48 giờ, cũng thấy có thang DNA xuất hiện (giếng 5).
Ở mẫu đối chứng không xử lý với cao chiết cồn sau 72 giờ (giếng 3), chúng tôi nhận thấy không có hiện tượng thang DNA xuất hiện, đồng thời lượng DNA tập trung gần sát miệng giếng cho thấy DNA của mẫu quần thể tế bào đối chứng này không bị phân cắt, vẫn ở dạng kích thước rất lớn nên không thể di chuyển xuống phía dưới được. Trong khi đó, ở mẫu quần thể tế bào xử lý với cao chiết cồn Linh chi vàng sau 72 giờ cảm ứng (giếng 4), không thấy có lượng lớn DNA tập trung ở sát miệng giếng như mẫu đối chứng, mà chỉ thấy có một vạch DNA mảnh, mờ, nằm thấp hơn về phía dưới, ở cùng vị trí với vạch DNA kích thước lớn của mẫu xử lý
với cao chiết 48 giờ và mẫu chứng dương. Chứng tỏ so với DNA của mẫu đối chứng thì DNA của mẫu có xử lý với cao chiết 72 giờ đã có sự phân cắt nhỏ hơn. Ở giếng 4, chúng tôi không nhận diện được thang DNA.
Ở mẫu có xử lý với cao chiết cồn 72 giờ, việc khó nhận diện được thang DNA đồng thời xuất hiện vạch DNA mảnh và mờ hơn vạch DNA của mẫu đối chứng, điều này có thể được giải thích như sau: một lượng lớn DNA của mẫu có xử lý với cao chiết cồn đã bị phân cắt nhỏ cho nên chỉ thu được một số ít DNA kích thước lớn (do ít DNA nên vạch mảnh hơn). Có thể ở 72 giờ các thể apoptotic đã bị vỡ, DNA trong thể apoptoctic bị phân hủy hết nên chúng tôi không thu được những đoạn DNA có kích thước đặc trưng 180bp hoặc bội số của nó, vì thế không xuất hiện được thang DNA.
Như vậy, kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh cho thấy có sự xuất hiện thang DNA ở mẫu tế bào HeLa xử lý với cao chiết cồn nấm Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng. Hiện tượng thang DNA xuất hiện là dấu hiệu đặc trưng và chắc chắn nhất của apoptosis [37]. Tiếp theo, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào HeLa của cao chiết cồn Linh chi vàng bằng phương pháp xác định hoạt tính caspase-3.