Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu

Cách thu nhận cao chiết cồn và cao chiết nước

ƒ Cao chiết cồn (ethanol)

Chiết hồi lưu bột nấm dược liệu 3 lần với ethanol 96% (mỗi lần trong 3 giờ) theo tỉ lệ 1:15 [dược liệu (kg):dung môi (lít)]. Dịch chiết được đem cô quay chân không ở 60oC thu được cao chiết cồn.

ƒ Cao chiết nước

Đun bột nấm dược liệu 3 lần với nước nóng (mỗi lần trong 1 giờ) ở 1000C trên bếp theo tỷ lệ 1:15 [dược liệu (kg):dung môi (lít)]. Đem cô cách thủy và thu được cao chiết nước.

Cách thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysacharide thô

ƒ Cách thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpene

Chiết hồi lưu bột nấm dược liệu 3 lần với methanol (mỗi lần trong 3 giờ) theo tỉ lệ 1:15 [dược liệu (kg):dung môi (lít)]. Dịch chiết được đem cô giảm áp thu được cao chiết MeOH (cao methanol).

Cao MeOH được hòa vào nước, lắc với dung môi diethyl ether, thu được dịch diethyl ether. Sau khi thu được dịch ete, phần còn lại được lắc tiếp với dung môi n-BuOH bão hòa nước, thu được dịch n-BuOH. Cho tiếp 150ml nước cất vào lắc tiếp và thu được dịch nước.

Đem cô giảm áp các dịch ete, dịch n-BuOH và dịch nước, thu được các cao chiết phân đoạn diethyl ether, n-BuOH và nước. Quá trình tách chiết cao phân đoạn được tóm tắt bằng sơ đồ hình 2.2.

Triterpene là những hợp chất có độ phân cực trải dài từ kém phân cực (triterpene tự do) đến phân cực (triterpene có gắn đường). Methanol là dung môi vạn năng có khả năng chiết được nhiều chất có độ phân cực khác nhau, trong đó có nhóm chất triterpene. Trong cao tổng MeOH có chứa các triterpene có độ phân cực khác nhau. Diethyl ether là dung môi kém phân cực có thể chiết lấy những hợp chất triterpene kém phân cực (triterpene tự do) từ trong cao tổng MeOH. Khi gắn với đường, các hợp chất triterpene có độ phân cực trung bình trong cao tổng MeOH có thể tan tốt trong dung môi n-BuOH, còn lại là những hợp chất triterpene có độ phân cực mạnh sẽ tan được trong nước.

Bột nấm dược liệu Chiết soxhlet (6h) Bã Dịch MeOH Cô giảm áp Cao MeOH, hoà lại trong nước

Diethyl ether Dịch Diethyl ether Lắc phân đoạn n-BuOH /H2O (150ml) Dịch n-BuOH H2O (150ml) Dịch H 2 O Cô giảm áp

Cô giảm áp Cô giảm áp

Cao Diethyl ether Cao n- BuOH Cao H

2

O

Hình 2.2. Quy trình thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpene

ƒ Cách thu nhận polysacharide thô

- Bước 1: Chiết nước (tỷ lệ 1: 20)

Bột dược liệu được đun hồi lưu với nước, lọc lấy dịch chiết, cô cạn bớt nước.

- Bước 2: Tủa polysaccharide 1:5

Cho từ từ cồn 96% vào dịch chiết nước theo tỷ lệ (1nước:5cồn), để qua đêm. Ly tâm lấy tủa, để khô tự nhiên, thu được polyssaccaride thô.

ƒ Cách pha cao chiết dùng trong các thử nghiệm

- Pha dung dịch mẹ (40.000 µg/ml) từ mẫu cao chiết đặc ban đầu. ƒ Mẫu cao chiết luôn được bảo quản ở 4oC.

ƒ Dung môi sử dụng để hòa tan cao chiết là DMSO (dùng hòa tan cao cồn, cao

MeOH, cao diethyl ether, cao n- BuOH) hoặc nước cất hai lần đã hấp khử trùng (hòa tan cao nước, polysacharide thô).

- Cách pha: cân một lượng cao chiết cho vào 1 eppendorf sạch, bổ sung thể tích dung môi thích hợp để đạt được nồng độ 40.000 µg/ml. Dùng máy ultralsonic để làm tan hoàn toàn cao chiết trong dung môi. Yêu cầu là cao chiết phải tan hoàn toàn trong dung môi, không có cặn tủa. Bảo quản dung dịch mẹ ở ở 40C.

- Sử dụng môi trường nuôi cấy E’MEM 10% FBS để pha loãng dung dịch mẹ này thành những nồng độ cần thử nghiệm.