pháp DNA phân mảnh)
Một trong những dấu hiệu tiêu biểu nhất của apoptosis là sự phân cắt DNA thành những phân mảnh với kích thước đặc trưng. DNA sợi đôi bị phân cắt ở những vùng nối giữa các nucleosome bởi một DNase có tên là CAD (caspase-activated DNase), tạo các phân mảnh có kích thước là bội số của 180 bp tương ứng với các nucleosome (xem hình 2.5).
Hình 2.5. Sự phân cắt DNA trong apoptosis
Các phân mảnh có kích thước là bội số của 180bp này tạo thành “thang DNA” (ladder DNA) khi chạy điện di trên gel agarose với thuốc nhuộm ethidium bromide. Đối với trường hợp necrosis, do sự phân cắt DNA không đặc hiệu sẽ tạo ra một hỗn hợp phân mảnh không đồng nhất, vì thế khi điện di trên gel agarose sẽ tạo thành vệt kéo dài gọi “smear” [12] ( xem hình 2.6).
A B
Hình 2.6. Sự điện di DNA bị phân cắt trong quá trình apoptosis và necrosis trên gel agarose. Hình A - hiện tượng “thang DNA” của quá trình apoptosis; Hình B
- hiện tượng “smear” của necrosis [12].
* Thử nghiệm được tiến hành như sau:
Quy trình tách chiết DNA
- Phủ tế bào vào các bình Roux (loại 25 cm2) với mật độ 7,5x105 tế bào/bình Roux và nuôi tế bào.
- Sau 2 ngày, khi tế bào trong các bình Roux đạt độ phủ khoảng 70-80%, cảm ứng tế bào bằng cách xử lý tế bào với mẫu dịch chiết ở nồng độ IC50. Mẫu chứng dương xử lý với Camptothecin 0,01 µg/ml và mẫu chứng xử lý với DMSO 0,25%.
- Sau các thời gian cảm ứng thích hợp, quan sát các biến đổi hình thái tế bào dưới kính hiển vi.
- Thu nhận tế bào (cả tế bào bám lẫn tế bào nổi). Thao tác thật nhẹ đối với các tế bào nổi để tránh ảnh hưởng đến màng tế bào.
- Xác định mật độ tế bào và tỷ lệ tế bào sống chết bằng thử nghiệm Tryphan blue. - Ly tâm tế bào 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Thu cặn.
- Rửa mẫu tế bào bằng dung dịch PBS 2 lần. Lưu ý hạn chế thời gian ủ tế bào trong PBS và huyền phù thật nhẹ cặn tế bào.
- Thêm 600 µl dung dịch ly giải để huyền phù cặn tế bào, để trong đá khoảng 60 phút (tế bào có thể tạo cụm trong khi thu nhận làm giảm hiệu quả ly giải, tuy nhiên tránh huyền phù mạnh để tách cụm trong khi ly giải, mẫu có thể được ủ lâu hơn để tăng hiệu quả ly giải).
- Ly tâm 12000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút. - Thu dịch nổi vào eppendorf mới.
- Thêm 1 thể tích phenol:chloroform/thể tích mẫu, đảo eppendorf trong 5 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thu dịch nổi.
- Lặp lại thao tác trên lần thứ 2.
- Thêm 1 thể tích chloroform/ thể tích mẫu vừa thu được. Đảo ống 6 lần. - Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thu dịch nổi. - Thêm 25-30 µl NaCl 5 M sao cho nồng độ cuối cùng là 300 mM.
- Thêm 2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh/ thể tích mẫu, đảo eppendorf. Ủ ở -20oC qua đêm.
- Ly tâm 12000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút. Thu tủa. -Rửa nhẹ bằng ethanol 70%.
- Ly tâm 12000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Thu tủa.
- Để khô tủa (để tủa khô ở nhiệt độ 60oC trong 5-10 phút), sau đó hòa cặn tủa trong 20 µl TE 1X. Thêm 1 µl Rnase A (10 mg/ml) vào và ủ trong 30-60 phút ở 37oC.
Kiểm tra sự phân mảnh của DNA
- Điện di các mẫu DNA trên gel agarose 2% ở hiệu điện thế 80V trong 1 giờ.