caffeine: khi tiến hành khử caffeine trên lá chè đã vò và chè khơ thì tổn thất catechin của q trình khử là
1.6.3 Phương pháp Swiss water 1Nguyên tắc
Phương pháp Swiss water được thực hiện dựa trên nguyên tắc là dùng than hoạt tính khử caffeine trong dịch trích để tạo ra dịch trích cân bằng, từ đó, tạo ra được một dịch trích đã bão hịa chất khơ nhưng khơng chứa hoặc chứa rất ít caffeine. Sau đó, dịch trích này sẽ được dùng để khử caffeine thay vì dùng nước thường [45].
1.6.3.2 Phương pháp thực hiên
Phương pháp Swiss water là một dạng của phương pháp khử caffeine bằng nước. Phương pháp này dựa trên lí thuyết về sự hịa tan của caffeine trong nước đã bão hịa chất khơ. Với dịch nước đã bão hịa chất khơ hịa tan (khơng tính caffeine), thì dịch nước sẽ khơng hịa tan thêm các thành phần khác trong lá chè, đặc biệt là catechin và các chất hòa tan mà chỉ hòa tan caffeine. Lá chè lúc đầu được trích ly bằng nước nóng. Khi đó, các thành phần chất hịa tan và caffeine hịa vào trong nước và tạo ra một dịch trích cân bằng về các chất hịa tan, các catechin, caffeine. Tiếp theo, caffeine được lấy ra khỏi dịch trích
bằng cách cho qua cột than hoạt tính. Dịng nước ra khỏi cột hấp phụ là dòng nước đã bão hòa các chất hịa tan nhưng khơng chứa caffeine. Dịng nước này có đặc tính là khơng thể trích ly thêm các chất hịa tan và các catechin nữa nhưng vẫn cịn khả năng trích ly caffeine. Điều này cho phép các mẻ tiếp theo có hiệu suất khử rất cao mà vẫn duy trì được các chất hịa tan trong lá chè ngun liệu. Dịng nước trích ly sau đó lại được cho qua cột than hoạt tính đã bão hịa chất khơ nhằm loại caffeine ra khỏi dịch trích. Q trình cứ thế tiếp tục cho các lần trích tiếp theo [45].
So với phương pháp khử caffeine bằng nước nóng bình thường thì phương pháp Swiss water phát huy những ưu điểm của phương pháp trên. Bên cạnh đó, nó khắc phục những nhược điểm của phương pháp dùng nước nóng như: phương pháp này tránh được việc tổn thất các chất khơ hịa tan, các catechin có trong nguyên liệu lá chè và tạo ra sản phẩm có hương vị tốt hơn. Phương pháp này được xem là khá hiệu quả cho quá trình khử caffeine trong lá chè tươi.
Ngày nay, việc sử dụng màng lọc membrane hay lọc than hoạt tính trong việc tách caffeine ra khỏi dịch trích trở nên khơng cịn hiệu quả kinh tế và thân thiện với môi trường [48]. Một hứơng phát triển mới trong việc tách caffeine ra khỏi dịch trích là việc sử dụng cơng nghệ enzyme và vi sinh vật [481- Vi sinh vật được cho vào dịch để khử caffeine trong dịch trích Swiss water và tạo ra một dịch trích đã bão hịa chất khơ hịa tan nhưng vẫn khơng chứa hoặc chứa rất ít caffeine. Một sơ"giơng vi sinh vật đã được nghiên cứu cho quá trình này như peudomunas, aspergillus, penicillium....
Quá trình khử caffeine ở sinh vật nhân nguyên thủy và sinh vật nhân thật đã và đang được nghiên cứu. Con đường tổng thể khử caffeine ở vi sinh vật được thể hiện như sau:[25]
Caĩtílne I
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Con đường demethyl hóa [Demethylase enzymes (in mammals CYP450
Con đường oxi hóa [Xanthine oxidase enzyme]
Hình 1-6: Mơ hình tổng thể của quá trình khử caffeine bằng vi sinh vật [25].
> Ớ sinh vật nhân thật: đôi với nhiều giống cây trồng, việc khử caffeine xảy ra trong suốt quá trình demethyl và sản phẩm cuối cùng tạo thành là xanthine. Phản ứng demethyl được xúc tác bởi những enzyme demethylase như N-l demethylase, N-7 demethylase và N-3 demethylase. Sau đó, xanthine được chuyển thành CƠ2 và NH3 bởi sự phá hủy vịng purine. Trái lại, ở một sơ" giông, con đường khử caffeine ở động vật là kết quả của sự hình thành methyl xanthines và methyl uric acids bởi những enzyme ở cytochrome P450 như CYP1A2, CYP3A4, CYP2E1 xanthine oxidase và N-acetyl transferase. Những xanthine này được methyl hóa và những acid uric hình thành trong quá trình khử caffeine được bài tiết ra ngoài cơ thể [251- Cịn đơi với nấm, sản phẩm đầu tiên của quá trình khử caffeine được tìm thấy là theophyline. Những xanthine dimethyl và monomethyl khác được tạo thành như một sản phẩm của quá trình khử caffeine. Tuy nhiên, con đường phân giải của các xanthine ở nấm chưa được biết một cách rõ ràng [251-
> Ớ sinh vật nhân nguyên thủy, con đường khử caffeine cũng chưa được tìm hiểu đầy đủ. Ớ vi khuẩn (tiêu biểu là giống Pseudomononas), caffeine được chuyển thành theobromine và paraxanthine bởi enzyme demethylase. Việc demethyl tạo ra các xanthine vđi 7- methylxanthine như là một sản phẩm trung gian. Sau đó, các xanthine, mono và dimethyl xanthine bị oxi hóa thành acid uric và đi vào con đường phân hủy purin. Ớ Serratia
marcescens, con đường phân hủy thì tương tự như ở Pseudomonas sp, ngoại trừ sự hình thành
sản phẩm trung gian methyl uric acid [25].
Trước đây, việc khử caffeine bằng vi sinh vật chưa được nghiên cứu nhiều vì caffeine vẫn được biết đến như một chất độc với vi khuẩn. Trong môi trường sinh sông của vi sinh vật, nồng độ caffeine lớn hơn 2.5mg/ml sẽ ức chế sự phát triển của một sơ" lồi vi khuẩn. Vì vậy, khi đó caffeine thường được sử dụng như một chất chông vi sinh vật giông như chloramphenicol. Những nghiên cứu về việc khử caffeine trong các dạng thực phẩm khác nhau bằng vi sinh vật chỉ thực sự được nghiên cứu kể từ năm 1970. Và kể từ đó đến nay, một vài thành tựu đã đạt được trong việc sử dụng caffeine như là một cơ chất cho sự phát triển của vi sinh vật. Đốì với vi khuẩn, những lồi có khả năng khử caffeine
được biết đến là Pseudomonas và Serratia genus. Fe2+ được xem là co-factor, nó xúc tác cho sự tạo thành enzyme demethylase. Chính vì vậy, sự có mặt của Fe2+ (0.04%) trong môi trường làm cho việc khử theobromine của Pseudomonas tăng gấp 10 lần [25]. Cịn đơi vđi các loại
nấm mốc, khả năng sử dụng caffeine như một cơ chất của quá trình trao đổi chât cũng được ghi nhận. Việc khử caffeine được thực hiện ở một vài loài nấm như Stemphylium sp,
Pénicillium sp và aspergillus sp. A tamari, A niger, A fumigus và p commune và kết quả cho
thấy sự phát triển của các loài khi sử dụng caffeine như là nguồn cung cấp nitrogen. A tamarí
và p commune thì cho thấy có khả năng khử caffeine tơt (60%) trong khi một vài loài khác là
thấp hơn 20% [25].
Tốc độ khử caffeine ở một sơ" lồi vi sinh vật quan trọng được cho ở bảng 1-12.
Báng 1-12; So sánh tốc độ khử caffeine ở những loài vi sinh vật khác nhau [ 2 5 1 Vi sinh vât Nồng độ caffeine ban đầu (g/l) Nguồn С (g/l) Quá trình khử caffeine (%) TỐC độ khử caffeine (g/giờ)
Klebsiella và 0.5 Glucose (1) 100% trong 10h 0.05
Rhodococcus
Serratia marcescens 0.6 - 100% trong 72h 0.008
Stemphyllium sp. 0.19 Sucrose (30.1) 100% trong 29h 0.0053
Pseudomonas putida 5 - 95% trong 50h 0.095
Aspergillus tamarii 1.2 Sucrose (28.4) 67% trong 48h 0.0536
Pénicillium commune 1.2 Sucrose (28.4) 61 % trong 48h 0.0521
> Như bảng trên ta thấy, việc khử caffeine ở vi khuẩn thì tơt hơn ở nấm mốc. Vì caffeine cũng là chất độc đốì với vi sinh vật nên nồng độ caffeine ban đầu trong q trình lên men có ý nghĩa quyết định. Ớ nấm mốc, sự tồn tại của các nguồn nitrogen bên ngoài sẽ ức chế hồn tồn q trình khử caffeine. Sự tồn tại của urea và ammonium sulphate thì ngăn cản quá trình khử caffeine của A. niger và Pénicillium verrucosum. Tuy nhiên, trái vđi nấm
mốc, sự tồn tại của các nguồn nitrogen hữu cơ bên ngồi thì khơng ngăn cản quá trình khử caffeine ở vi khuẩn.
> pH ban đầu của môi trường cũng là một thơng sơ" quan trọng ảnh hưởng đến q trình khử caffeine. pH của mơi trường nên có tính axit (4 — 3.2) đối với Penicillium roqueforti và là
bazơ đôi với Aspergillus sp.
So vđi phương pháp Swiss water kết hợp với than hoạt tính trong việc khử caffeine thì phương pháp Swiss water kết hợp với vi sinh vật cho kết quả khử caffeine cao hơn và hồn tồn sạch với mơi trường do không dùng bất cứ dung môi nào [481- Trong phương pháp dùng than hoạt tính thì ta phải sử dụng dung mơi trong việc rửa giải caffeine khỏi than hoạt tính cịn phương pháp này thì hồn tồn khơng dùng bất cứ một dung mơi nào.
1.6.4 Phương pháp khử caffeine bằng CƠ2 siêu tới hạn1.6.4.1 Nguyên tắc