CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vikhuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vikhuẩn B.thuringiensi sở Việt Nam
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về B. thuringiensis ở Việt Nam đƣợc
khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều cơng trình của các tác giả nhƣ Nguyễn Cơng Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngơ Đình Bính, những ngƣời đầu tiên mở đƣờng nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam (Đặng Trọng Lƣơng và cộng sự, 1999).
Thời kỳ đầu, các nghiên cứu, công bố khoa học về B. thuringiensis cịn rất ít. Một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis bằng phƣơng pháp thủ công và bán công nghiệp trong phịng thí nghiệm sử dụng các chủng B. thuringiensis thuộc loài phụ B. thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã đƣợc sử dụng cho vùng rau ngoại
thành Hà Nội và thu đƣợc các kết quả tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lƣợng khbơng cao nên tốc độ tiêu thụ giảm (Phan Cự Nhân và cộng sự, 2004; Đặng Trọng Lƣơng và cộng sự, 1999).
Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994). Ở thời kỳ này, các chế phẩm B.
thuringiensis sản xuất theo phƣơng pháp dịch thể đƣợc áp dụng rộng rãi, có hiệu
chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trƣờng đại học đề xuất phƣơng án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phƣơng pháp lên men hở không cần vô trùng nhƣng đã không thu đƣợc kết quả tốt (Đặng Trọng Lƣơng và cộng sự, 1999).
Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay). Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất lƣợng
không tiêu thụ đƣợc. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bƣớc vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hƣớng mới nhƣ tìm kiếm các chủng B. thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản
xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B. thuringiensis phục vụ sản xuất (Đặng Trọng Lƣơng và cộng sự, 1999). Các nghiên
cứu của Ngơ Đình Bính và cộng sự cho thấy các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003). Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H và đã chế tạo đƣợc 34 bộ sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại B. thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh. Phƣơng pháp PCR với hỗn hợp các cặp mồi đặc hiệu cho 7 gen thuộc nhóm gen cry typ 1 cho thấy có 102 chủng B. thuringiensis trong tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88,7%), đáng chú ý là các chủng chứa 5 gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C và cry1D - chiếm 6,8% (Đái Duy Ban, 2006).
Trên cơ sở phát hiện, tách dịng và đọc trình tự gen có trong các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngơ Đình Bính và cs đã tách dịng và biểu hiện
gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt. aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu đƣợc đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đôi chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng
muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông (Đái Duy Ban, 2006).
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã đƣợc bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu
vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium fumefaciens để tạo ra các giống
cây trồng mới có khả năng kháng sâu nhƣ: cây đậu xanh, cây cải bông...(Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự, 2004; Khuất Hữu Thanh và cộng sự, 2003; Đặng Trọng Lƣơng và cộng sự, 1999). Năm 2012, Phan Tƣờng Lộc và cs đã chuyển gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab vào cây mía thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Phan Tƣờng Lộc và cộng sự, 2012).
1.2. Gen cry2
Các gen cry2 mã hóa protein tinh thể khoảng 65 – 71 kDa, đƣợc sản sinh bởi một số phân loài của B. thuringiensis nhƣ: kurstaki (HD-1, HD-263, NRD-12 và 14 dòng khác), thurigiensis, tolwwarthi, israelensis, kenyae… (Dwu và cộng sự, 1991; Ohba và
Aizawa, 1986; Yamamoto, 1983). Cho đến nay, hơn 80 gen cry2 đã đƣợc phát hiện
(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/B.thuringiensis/toxins2.html).Wi nder và Whiteley (1989) tách dòng hai gen liên quan đến cry2A và cry2B từ vi khuẩn
B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. Cả hai gen mã hóa protein chứa 633 axit amin
với khối lƣợng phân tử khoảng 71 kDa. Mặc dù hai protein Cry tƣơng đồng tới 87% axit amin, nhƣng chúng khác nhau trong phổ diệt cơn trùng. Cry2A độc hại đối với lồi cánh vảy (M. sexta) và hai cánh (A. aegypti), trong khi đó Cry2B và Cry2C gây độc cho loài cánh vảy. Các gen cry2A và cry2C xuất hiện nhƣ vùng gen thứ ba của một operon ba gen (Orf1, Orf2 và cry2A) (Yamamoto and McLaughlin, 1981). Tuy nhiên sự
hình thành protein Cry2A địi hỏi phải có khung đọc mở (Orf2), trong khi hai Orf
phía đầu của gen cry2C khơng có vai trị trong hình thành protein Cry2C (Duong và cộng sự, 2013). Mặt khác, gen cry2B là rất khó xác định. Để có đƣợc biểu hiện mạnh hơn của một gen cry2B từ B. thuringiensiskurstaki HD-1, Dankocsik và cộng sự
(1990) đã hợp nhất gen này tại vùng điều hòa của một gen cry3A. Kết quả là các độc tố Cry2B có độc tính cao với bộ cánh màng bao gồm Lymantria dispar, Heliothis virescens, Trichoplusiani. (Dankocsik và cộng sự, 1990).
Ngƣời ta tìm thấy protein Cry2B có độc tính cao đối với Lymantria dispar, Heliothis virescens và Trichoplusiani, nhƣng không độc hại đối với muỗi Aedes aegypti (Crickmore và cộng sự, 1998; Winder và cộng sự, 1989). Độc tố Cry2A
chống lại hoạt động của cơn trùng.Đối với việc kiểm sốt sâu bọ cánh phấn, các chế phẩm BT từ Cry1 và Cry2 đang đƣợc sử dụng hoặc ở dạng xịt (spray) hoặc ở dạng cây chuyển gen (Ferre và cộng sự, 2008; Schnepf và cộng sự, 1998). Cây bông chuyển gen thế hệ thứ 2 mang cả 2 gen cry1Ac và cry2Ab (Ferrevà cộng sự, 2008). Kể từ khi cry - loại chất độc đƣợc sử dụng rộng rãi trong các cây chuyển gen đã có những nghiên cứu cho rằng cơn trùng đã phát triển sức đề kháng chống lại các chất độc này. Akhurst và cộng sự (2003) đã đƣa ra kết quả nghiên cứu về sức đề kháng của sâu bệnh trên cây bông đối với cry1Ac của B. thuringiensis. Pakistan
Maqboolvà cộng sự (1998) đã tạo ra lúa biến đổi gen, cho thấy gen cry2A là hiệu
quả đối với sâu hại cây lúa tại khu vực Ấn Độ - sâu đục thân màu vàng và sâu cuốn lá lúa. Sau đó, Zaidi (2005) đã tạo cây thuốc lábiến đổi gen, Nicotiana tabacum với
cry2A để bảo vệ chống lại Heliothis virescens. Tuy nhiên, thơng tin về gen cry2 vẫn
cịn hạn chế và chƣa đầy đủ ở những khu vực khác nhau. Những công bố về cấu trúc và chức năng trong những năm gần đây khơng có cơng bố, chí cố một số kết quả về phân lập và sàng lọc thêm những gen cry2mới (Baonan, 2013; Guihua và
cộng sự, 2013; Sevim và cộng sự, 2013; Xiu và cộng sự, 2013; Zonglan và cộng sự, 2014; Ziuhuan, 2014; Indraarulselvi và Reyaz, 2014; Guihua, 2014; Yakun, 2015; Ling, 2016).