STT
Nồng độ bổ sung (g/l)
Bột đậu tương MnSO4. MgSO4.7H2O
1 5 0 0,8 2 6,36 0,05 0,45 3 3 0,134 0,45 4 1 0,1 0,8 5 3 0,05 0,45 6 1 0 0,8 7 5 0,1 0,1 8 3 0,05 0 9 3 0,05 0,45 10 3 0,05 1,038 11 3 0,05 0,45 12 5 0 0,1 13 5 0,1 0,8 14 1 0,1 0,1 15 3 0,05 0,45 16 3 0 0,45 1 0 0,05 0,45 18 1 0 0,1 19 3 0,05 0,45 20 3 0,05 0,45
Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở bình tam giác với thể tích 50 ml mơi trƣờng/bình 250 ml. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại ba lần trong cùng một điều kiện, lấy số liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Design expert 10.1
*/ Xử lý số liệu
Tập hợp dữ liệu định lƣợng nhận từ thiết kế các yếu tố, nhằm giải quyết đồng thời sự tác động của các yếu tố bằng phƣơng trình đa biến. Các thành phần mơi trƣờng đã lựa chọn có ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bt đƣợc tối ƣu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, tổng số các phƣơng án xử lý là 2k+2k+n0. Trong đó “k” là biến số độc lập, n0 là số thí nghiệm lặp lại ở tâm. Sử dụng quy hoạch trực giao đối xứng cho ba yếu tố tác động (nồng độ Ca, Mg và cám gạo) phần mềm Design expert 10.1cho ra 20 thí nghiệm. Các biến Xi đƣợc mã hóa là xi theo phép biến đổi sau:
xi = Xi – X0/δX
Trong đó xi là giá trị đƣợc mã hóa vơ hƣớng của biến số Xi, X0 là giá trị của Xi tại tâm điểm và δX là bƣớc thay đổi (bƣớc nhảy). Để tối ƣu hóa thành phần mơi trƣờng ngƣời ta sử dụng thiết kế có k yếu tố. Phƣơng trình tối ƣu các thành phần mơi trƣờng đƣợc đƣa ra dựa trên cơ sở của phƣơng trình bậc hai sau:
Y = β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj
Trong đó Y là kết quả dự đoán, β0 là giới hạn bị chặn, βi là ảnh hƣởng tuyến tính, βii là ảnh hƣởng bậc hai và βij là sự tƣơng tác qua lại.
Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Design expert 10.1để phân tích các hệ số hồi quy, bề mặt đáp ứng và tối ƣu hóa với thuật tốn “hàm mong đợi”.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis chủng Bacillus thuringiensis
3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus
Để phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B.thuringiensis có hoạt tính diệt cơn
trùng bộ 2 cánh (Diptera), 317 mẫu đất, lá đã đƣợc thu thập tại 7 tỉnh thành từ 7 vùng địa lý của Việt Nam (Hình 3.1). Các địa điểm này trƣớc đó chƣa từng sử dụng các chế phẩm sinh học.
Hình 3.1. Sự phân bố của các chủng Bt phân lập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam
Sử dụng các mẫu đất, lá này làm nguồn phân lập B. thuringiensis. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 30oC, trên bề mặt môi trƣờng đã xuất hiện nhiều loại khuẩn lạc khác nhau, trong đó có các khuẩn lạc thuộc chi Bacillus là những khuẩn lạc trịn, màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc khơng nhăn (Hình 3.2).
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn B.thuringiensis trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ ni cấy ở 300C
Tiếp đó, những khuẩn lạc có hình thái bên ngồi đặc trƣng cho nhóm vi khuẩn Bacillusđƣợcnhuộm với thuốc nhuộm Fushin bazơ để quan sát dƣới kính
hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần nhằm kiểm tra khả năng hình thành bào tử và tinh thể.
Trong 317 mẫu đất, lá thí nghiệm có 198 mẫu mang vi khuẩn Bacillus và 119 mẫu không phân lập đƣợc B. thuringiensis. Nhƣ vậy tần suất xuất hiện của Bacillus là 62,4%. Những khu vực có tỉ lệ Bacillus cao trong mẫu: Kiên Giang (75,0%),
Điện Biên (72,8%) và Hà Nội (72,8%); thấp nhất là Nghệ An (33,3%).
Trong số 1.020 khuẩn lạc với các đặc điểm thuộc chiBacillus, có 440 khuẩn lạc thuộc nhóm B. thuringiensis dựa trên khả năng hình thành tinh thể (chiếm 43%). Tỉ lệ này phụ thuộc vào số mẫu lấy đƣợc ở các tỉnh, cao nhất ở các mẫu đƣợc thu thập ở Hà Nội (54%) và thành phố Hồ Chí Minh (53%), thấp nhất ở mẫu thu thập ở Lâm Đồng (25%), các tỉnh Điện Biên và Kiên Giang cho tỉ lệ tƣơng đƣơng nhau (42% và 44%). Số liệu chi tiết đƣợc trình bày tại biểu đồ hình 3.3.
Hình 3.3.Kết quả phân lập của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam
Các mẫu đất đƣợc thu thập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam có tần suất Bt cao hơn so với những công bố trƣớc đây (Martin và Travers, 1989; Binh và cộng sự, 2005). Tần suất B.thuringiensis trong nghiên cứu này là 62,4% điều này hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đây của Martin và Travers (1989), trong mẫu đất của New Zealand (Chilcott và Wigley, 1993), trong mẫu đất của Hàn Quốc ( Lee và cộng sự, 1995) và trong mẫu đất của nhật Bản (Ohba và Aizawa, 1986).
Sự xuất hiện của B.thuringiensishầu nhƣ khắp nơi trong môi trƣờng sống,
bao gồm: đất nông nghiệp, đất rừng, đất đô thị, đất ngập mặn, thậm chí cả sa mạc (Dulmage và Aizawa,1982; Martin và Travers, 1989; Zhang và cộng sự, 2000; Uribe và cộng sự, 2003). Trong nghiên cứu này, sự xuất hiện của Bt tập trung chủ yếu ở Hà Nội thuộc đất thành thị và có mật độ dân số cao. Kết quả này cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Quesada-Moraga (Quesada-Moraga và cộng sự, 2004), phù hợp với kết quả của Ayyasamy (2012). Theo Ayyasamy, tỉ lệ Bt ở đất thành thị là 80%, tuy nhiên tần suất xuất hiện cao nhất ở đất nông nghiệp (Ayyasamy và cộng sự, 2012).
Nhƣ vậy, so với số liệu cơng bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện Bt và chỉ số Bt mà đề tài phân lập đƣợc là khá cao. Chứng tỏ số lƣợng vi khuẩn Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý.
Từ 317 mẫu đất, lá thu thập tại 7 tỉnh thành thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam đã phân lập đƣợc 198 mẫu Bacillus, chiếm tỉ lệ 62,4%, phân bố cao ở các tỉnh Kiên Giang (75,0%), Điện Biên (72,8%) và Hà Nội (72,8%). Phân lập đƣợc 1020 khuẩn lạc thuộc chi Bacillus, với 440 khuẩn lạc có khả năng hình thành bào tử và
tinh thể, chiếm tỉ lệ 43%.Các chủng B. thuringiensis đƣợc tiếp tục xử lý để xác định hình dạng tinh thể.
3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể
Các chủng B. thuringiensis có khả năng sinh ra các dạng tinh thể: hình cầu, hình lƣỡng tháp, hình lập phƣơng, hình khơng xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Hình 3.4. Hình ảnh tinh thể của các chủng Bt phân lập tại Việt Nam chụp bằng kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10000 lần.
A: Hình lƣỡng tháp; B: Hình lƣỡng tháp và hình lập phƣơng; C: Hình cầu; D: Hình lập phƣơng và hình cầu; E: Hình lƣỡng tháp, lập phƣơng và hình cầu; F: Hình lƣỡng tháp, lập phƣơng và hình khơng xác định
440 chủng B. thuringiensisđã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam
đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng MPA. Sau 3 ngày quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn.
A B C
Hình 3.5.Kết quả phân loại hình thái tinh thể của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam.
Kết quả Hình 3.4 và 3.5 cho thấy, tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh thể ở tất cả các hình dạng. Có những chủng có khả năng sinh từ 1 – 3 loại tinh thể. Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lƣỡng tháp (42,2%); 193/440 chủng sinh tinh thể hình cầu (43,8%); 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập phƣơng (10,5%); 15/440 chủng sinh tinh thể hình khơng xác định (3,5%).
Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại tỉnh Thành Đơ – Trung Quốc có dạng hình tháp lƣỡng cực và hình cầu, chiếm tới 91,8% (Yu và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các chủng
B. thuringiensis thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phƣơng
(26,9%) và hình tháp lƣỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan, 2010). Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là dạng khơng định hình (27%) và tháp lƣỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự, 2014). Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập đƣợc trong nghiên cứu này cũng nhƣ trong các nghiên cứu khác có thể do sự khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng B. thuringiensis cũng nhƣ đặc điểm protein Cry của các chủng thu thập đƣợc.
Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang gen cry2A rất đa dạng chúng có thể sinh ra từ các dƣới loài Bt. serovar kurstaki,Bt. serovar sotto, Bt.serovar israelensis, Bt. serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình cầu
và hình lƣỡng tháp. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch.
3.1.3. Phân loại các chủng B. thuringiensis phân lập
Vi khuẩn B. thuringiensis đƣợc chia ra làm rất nhiều dƣới loài khác nhau,
mỗi dƣới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Cho đến nay, có ít nhất 82 dƣới lồi B.
thuringiensis đã đƣợc phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch với kháng nguyên H
(Horani và cộng sự, 2003; Joung và Côte’; 2001; Lecadet và cộng sự, 1999; Roh và cộng sự, 2009). Theo các tài liệu đã đƣợc công bố trên thế giới,các dƣới loài Bt. kurstaki, Bt. tolwwarthi , Bt. sotto, Bt. israelensis, Bt. kenyae... có khả năng diệt
cơn trùng bộ hai cánh. Từ các chủng vi khuẩn B. thuringiensis phân lập đƣợc có khả năng sinh tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp, lựa chọn đƣợc 45 chủng để phân loại bằng kít huyết thanh miễn dịch.
Với kít huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật cho 60 dƣới lồi B. thuringiensis khác. Thơng qua phản ứng ngƣng kết với các typ
huyết thanh, xác định đƣợc 32 chủng B. thuringiensis (chiếm 71%), trong đó có 5
chủng thuộc dƣới loài Bt. serovar. kurstaki, 2 chủng Bt. serovar israelensis (Bảng 3.1). Các chủng cịn lại khơng ngƣng kết với các huyết thanh hiện có trong bộ sƣu tập của phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học. Nguyên nhân có thể chúng thuộc các dƣới lồi cịn lại hoặc là dƣới lồi mới.
Hình 3.6. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học.
A: Trƣớc khi nhỏ huyết thanh miễn dịch
B: Sau khi nhỏ huyết thanh miễn dịch typ 3a,3b
Bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch, xác định đƣợc 7 chủng thuộc 2 dƣới loài Bt. serovar. kurstaki, Bt. serovar israelensis. Các chủng này sẽ đƣợc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) và sàng lọc gen
cry2A.
Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh
STT Dƣới loài Bacillus thuringiensis Typ huyết thanh Số chủng ngƣng kết Tỷ lệ (%)
1 Bacillus thuringiensisserovar israelensis 14 2 6,25 2 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki 3a,3b 5 15,62 3 Bacillus thuringiensisserovar
sumiyoshiensis
3d 9 28,13
4 Bacillus thuringiensisserovar coreanensis 25 4 12,5 5 Bacillus thuringiensisserovar neoleonensis 24a, 24b 2 6,25 6 Bacillus thuringiensisserovar aizawai 7 5 15,63 7 Bacillus thuringiensisserovar yunnanensis 20a, 20b 1 3,13 8 Bacillus thuringiensisserovar pakistani 13 3 9,38 9 Bacillus thuringiensisserovar oswaldocruzi 38 1 1,39
Tổng số chủng phản ứng dƣơng: 32 chủng chiếm 71,11% Số chủng phản ứng âm: 13 chủng chiếm 28,89%
Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện ở tất cả các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki. Ngoài ra, chủng B. thuringiensis serovar israelensis cũng đƣợc tìm thấy phổ biến ở các môi trƣờng sống của muỗi
(Martinez và Caballero, 2002). Do đó, các chủng thuộc nhóm này sẽ đƣợc đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng B.
thuringiensis thuộc dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar israelensis ta pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả. Phƣơng pháp thử hoạt tính diệt ấu trùng đã mơ tả trong phần 2.3.3.
Tỷ lệ ấu trùng chết đƣợc tính sau 3 và 5 ngày thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng
B. thuringiensis sau 3 và 5 ngày thử nghiệm
Tên chủng
Bacillus thuringiensis
Thử nghiệm với ấu trùng muỗi
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi đục quả Tỉ lệ chết sau 3 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 3 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 7 ngày (%) LD 2.21 66,67 90,33 83,33 100 LNT 7.12 66,67 96,67 83,33 100 16,67 33,33 LNT 16.6 73,33 83,33 86,67 100 13,33 16,67 MSS 1.1 50 100 66,67 83,33 3,33 10 MSS 4.2 46,67 78,67 60 76,67 0 10 MSS 6.3 63,33 98,33 80 100 13,33 20 MSS 8.4 80 100 93,33 100 20 33,33
4D4 6,67 30 16,67 30 0 0 Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B. thuringiensis đƣợc tuyển chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao. Tỷ lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời gian thí nghiệm. Ở nồng độ 109 bào tử/ml các chủng đƣợc lựa chọn có tỷ lệ ấu trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày. Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi đục quả là tƣơng đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm.
Trong số các chủng phân lập đƣợc, chủng LNT 7.12 và MSS 8.4 cho khả năng diệt ấu trùng cao. Do vậy, 2 chủng này đƣợc nghiên cứu sâu hơn về gen cry2A để có thể xác định sự có mặt của gen cry2A có liên quan đến khả năng diệt ấu trùng hay không và nghiên cứu tạo chế phẩm diệt bộ hai cánh.
3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt cơn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập
3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR huyết thanh bằng phương pháp PCR
Để khẳng định khả năng diệt ấu trùng bộ hai cánh ở 2 chủng có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà tốt nhất có phải đƣợc quy định bởi gen cry2A hay không, đề tài
tiến hành phân lập gen cry2Atừ hai chủng này và nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp, đánh giá khả năng diệt ấu trùng của protein Cry2A tái tổ hợp.
Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen cry2A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc
hiệu đƣợc thiết kế dựa vào các đoạn bảo thủ của gen cry2A đã đƣợc công bố trên ngân hàng thu đƣợc sản phẩm có chiều dài 1902 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Theo các nghiên cứu trƣớc, các chủng mang tinh thể hình thoi có thể có mặt của gen cry1. Kết quả sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho
gen cry1 cũng thể hiện, 7 chủng nghiên cứu có sự xuất hiện của gen cry1 (kết quả không đƣợc thể hiện). Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phƣơng pháp PCR cho thấy, 7 chủng thuộc 2 dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis
serovar israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thƣớc khoảng 1,9 kb (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả PCR sàng lọc các 7 chủng B. thuringiensis bằng cặp mồi khuếch đại gen cry2A
1: LD 2.21; 2: LNT 7.12; 3: LNT 16.6; 4: MSS 1.1; 5: MSS 4.2; 6: MSS 6.3; 7: MSS 8.4; M: Thang DNA chuẩn (HighRanger, Norgenbiotek)
Trong nghiên cứu này, đề tài kiểm tra sự có mặt từ gen cry2A từ 7 chủng, gen
cry2A từ 2 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà cao nhất đƣợc giải trình tự.
3.2.2. ách dịng và đọc trình tự gen cry2A
Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất đƣợc khuếch đại vàgắn vào vector tách dòng PCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coliDH5α.
Sau 14 - 16 giờ cấy trải lên môi trƣờng chọn lọc LB, Ampicilin 50 µg/ml, ở 37oC, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Từ 4 dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu đƣợc đoạn kích thƣớc đúng nhƣ tính tốn (khoảng 1,9 kb) (Hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4
1-4: Sản phẩm PCR dòng biến nạp gen từ chủng LNT7.12; 5-8: Sản phẩm PCR dòng biến nạp gen từ chủng MSS8.4; 9: Đối chứng âm; M: Thang DNA chuẩn