STT Chỉ tiêu Đơn vị Phƣơng pháp
phân tích Kết quả Axit nhiệt Vơ trùng Kiềm nhiệt 1 Tổng Nito mg/l TCVN6638:2000 110,00 108,00 93,30 2 Tổng Phopho mg/l TCVN6202:2008 5,25 6,73 9,48 3 Tổng cacbon mg/l TCVN 6642:2000 400,00 360,00 370,00 4 Al mg/l SMEWW3125:2012 0,176 0,140 0,162 5 Ca 28,500 14,800 12,900 6 Cd 0,0003 0,0002 < 0,0002 7 Cr 0,046 0,025 0,020 8 Cu 0,037 0,016 0,023 9 Fe 1,210 1,470 1,220 10 K 4,090 3,270 3,230 11 Mg 12,000 8,410 6,870 12 Na 48,600 64,300 67,400 13 Ni 0,096 0,061 0,057 14 Pb 0,005 0,004 0,004 15 Zn 0,421 0,193 0,138 16 Mn 0,136 0,066 0,136
Kết quả phân tích ở bảng 3.6 cho thấy, trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt hàm lƣợng C, N (hai nguồn cơ chất quan trọng nhất trong sinh trƣởng của vi khuẩn) cao hơn hẳn so với dịch bã bia thủy phân bằng phƣơng pháp kiềm nhiệt hoặc chỉ vơ trùng.Kết quả này hồn tồn phù hợp với nhận định ở trên, khi cho rằng tác nhân axit ở điều kiện nhiệt độ cao đã giúp tăng khả năng phân
hủy các hợp chất cao phân tử, làm tăng hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ dễ hấp thu trong dịch thủy phân.
Các nguyên tố khoáng là nhân tố khơng thể thiếu trong q trình sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn nói chung và các chủng thuộc gen Bt nói riêng. Trong đó,
các ion kim loại nhƣ Mg, Mn, Fe, Zn, Ca, v.v... có tác dụng điều tiết quan trọng đến sinh trƣởng, hình thành bào tử cũng nhƣ sinh tổng hợp protein tinh thể diệt côn trùng. Do vậy, trong môi trƣờng tổng hợp lên men vi khuẩn thƣờng đƣợc bổ sung thêm một số muối khoáng với nồng độ nhƣ sau: 0,3% MgSO4.7H2O; 0,02%o MnSO4.7H2O; 0,02%o FeSO4.7H2O; 0,2%o ZnSO4.7H2O và 1,0%o CaCO3 (Ngơ Đình Bính, 2000). Xét theo nhu cầu khống này của vi khuẩn B. thuringiensis thì khơng có ngun tố nào ở cả ba thí nghiệp đáp ứng đủ nhu cầu khoáng. Do vậy, phải bổ sung thêm khoáng vào dịch thủy phân bã bia để cải thiện chất lƣợng môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4.
Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Ozkan và các cộng sự: ở nồng độ 10-6M, Mn là yếu tố chủ chốt tác động đến sự sinh tổng hợp độc tính của vi khuẩn B. thuringiensis mà không ảnh hƣởng tới quá trình khác của tế bào. Trong dịch thủy
phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt (Bảng 3.6), Mn có nồng độ 0,136 mg/l (2,7x10-6M/l) là nồng độ nằm trong khoảng nồng độ phù hợp cho lên men vi khuẩn
B. thuringiensis thu độc tố delta endotoxxin(Ozkan và cộng sự, 2003).
Theo nghiên cứu ca Iỗgen v cỏc cng s, s sinh trng, hỡnh thành bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Btkkhông chỉ phụ thuộc vào các yếu tố dinh dƣỡng cacbon, nito mà còn chịu tác động rất lớn từ các nhân tố khoáng. Cụ thể, khi bổ sung Mg ở nồng độ từ 8x10-5M đến 4x10-3M mật độ tế bào và nồng độ protein tinh thể tng mnh (Iỗgen v cng s, 2002). Theo kt qu phân tích ở bảng 3.6 nồng độ của Mg trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt là 12 mg/l (2,9x10-3M), đây là nồng độ Mg nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển và sinh độc tố của vi khuẩn B. thuringiensis theo nh nghiờn cu ca Iỗgen.
Nhƣ vậy, tiền xử lý bã bia là một bƣớc quan trọng và cần thiết phải thực hiện khi sử dụng bã bia làm nguyên liệu nuôi vi khuẩn B. thuringiensis sinh độc tố diệt
ấu trùng ruồi. Kết quả phân tích dịch thủy phân bã bia và kết quả thử nghiệm lên men vi khuẩn MSS8.4 đều cho thấy phƣơng pháp axit nhiệt là phù hợp để tiền xử lý bã bia.
3.3.1.3.Xác định nồng độ bã bia phù hợp làm môi trường lên men vi khuẩn MSS8.4
Thành phần và nồng độ của các hợp chất hữu cơ (cacbon, nito, khống...) trong mơi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình sinh trƣởng, hình thành sản phẩm lên men của vi sinh vật (Nguyễn Hoài Trâm, 2004). Nồng độ quá cao hay quá thấp sẽ ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói riêng. Việc xác định nồng độ cacbon, nito và khống trong mơi trƣờng lên men là rất khó khăn vì nó có mối tƣơng quan qua lại lẫn nhau. Thông thƣờng phải dựa trên kết quả thực nghiệm để xác định nồng độ phù hợp cho mục đích lên men khác nhau. Theo kết quả phân tích ban đầu, bã bia có chứa đầy đủ các thành phần cacbon, nito, khoáng ở các tỷ lên khác nhau. Do vậy, cần phải tiến hành các thí nghiệm ở nhiều nồng độ để tìm ra nồng độ phù hợp nhất cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn B. thuringiensis.
Dựa trên kinh nghiệm thực tế và tham khảo các tài liệu liên quan, các thí nghiệm lên men vi khuẩn MSS8.4 sử dụng bã bia đƣợc thực hiện ở các nồng độ nhƣ sau: 1%TS; 1,5%TS; 2%TS; 2,5%TS; 3%TS; 3,5%TS. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ bã bia đến sinh trƣởng, sinh protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4. Ký hiệu thí nghiệm Nồng độ bã bia (%TS) Mật độ TCC (CFU/ml) Mật độ SC (CFU/ml) Nồng độ delta - endotoxin (mg/l) TN1 1,0 2,9x107 1,2 x 107 306 ±9 TN2 1,5 6,3x 107 5,1 x 107 411 ±10 TN3 2,0 1,5 x 108 1,3 x 108 422 ±9 TN4 2,5 2,3 x 108 2,2 x 108 434 ±9 TN5 3,0 1,7 x 108 1,1 x 108 315 ±10 TN6 3,5 2,0x 107 5,3 x 105 -
Ký hiệu thí nghiệm Nồng độ bã bia (%TS) Mật độ TCC (CFU/ml) Mật độ SC (CFU/ml) Nồng độ delta - endotoxin (mg/l) Đối chứng MTCS 9,2 x 108 8,8 x 108 537 ±10 Các kết quả nghiên cứu cho thấy: tỷ lệ % chất khô của bã bia nằm trong khoảng từ 2 – 3là phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn B. thuringiensis. Ở nồng độ thấp (1%TS) mật độ vi khuẩn trong mẫu sau 48 giờ lên men chỉ đạt 2,9x107CFU/ml, trong khi đó ở nồng độ 2,0 – 3,0%TS mật độ tế bào sau 48 giờ lên men đạt trên 108CFU/ml. Trong thí nghiệm 6 khi tăng nồng độ bã bia lên 3,5%, mật độ tế bào thu đƣợc sau 48 giờ lên men không cao chỉ đạt 107CFU/ml. Điều này, có thể do ở nồng độ 3,5%TS độ nhớt của dịch lên men lớn, khả năng hịa tan của ơxi vào môi trƣờng kém không đáp ứng đƣợc nhu cầu ôxi cho quá trình tăng sinh tế bào. Hơn nữa, sự mất cân đối trong thành phần dinh dƣỡng cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến mật độ tế bào thấp sau 48 giờ lên men.
Trong lên men vi khuẩn B. thuringiensis, mật độ bào tử cũng là một yếu tố
quan trọng quyết định đến hiệu quả của mẻ lên men. Do vậy, bên cạnh việc chọn tỷ lệ %TS phù hợp cho sinh trƣởng cũng phải quan tâm đến mật độ bào tử tạothành và tỷ lệ chuyển hóa từ tế bào dinh dƣỡng thành bào tử vì trong quá trình bảo quản chế phẩm, dạng bào tử sẽ tồn tại đƣợc lâu, sản phẩm không bị giảm về chất lƣợng. Nếu tế bào khơng chuyển hóa thành bào tử, trong q trình bảo quản, các tế bào khơng có oxi, thiếu dƣỡng chất sẽ bị chết, làm giảm mật độ tế bào, phát sinh ra mùi hơi thối khó chịu giảm chất lƣợng của sản phẩm, giảm thời gian sử dụng sản phẩm. Trong 6 thí nghiệm thực hiện, thí nghiệm 3, 4 đều cho tỷ lệ chuyển hóa thành bào tử trên 90%. Nhƣ vậy, tỷ lệ 2 - 2,5%TS là thích hợp cho sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của chủng MSS8.4.
Hình 3.22. Tỷ lệ chuyển hóa thành bào tử sau 48 giờ lên men
Protein tinh thể đƣợc sinh ra đồng thời với quá trình hình thành bào tử và là sản phẩm mong muốn trong quá trình lên men vi khuẩn MSS8.4. Do vậy, đây là một chỉ tiêu quyết định đến chất lƣợng sản phẩm. Kết quả thí nghiệm trong bảng 3.6cho thấy ở nồng độ bã bia 2,5% nồng độ protein tinh thể đạt đƣợc là cao nhất. Nhƣ vậy, xét về mặt tổng thể nồng độ 2,5%TS là phù hợp nhất cho lên men MSS8.4 thu độc tố diệt ấu trùng ruồi. Nồng độ 2,5%TS sẽ đƣợc sử dụng cho tất cả các nghiên cứu về sau.
3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trưởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4. 3.3.2.1. Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào môi trường bã bia
Dựa trên nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn B. thuringiensis nói riêng các nguồn dinh dƣỡng đƣợc chọn bao gồm: MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl, KH2PO4, K2HPO4 và các phụ phẩm của ngành nông nghiệp (cám gạo, cám ngô, bột đậu tƣơng). Các thí nghiệm đƣợc bố trí cụ thể nhƣ mục 2.3.16.4 (Chƣơng 2,Vật liệu và phƣơng pháp). Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Xác định mật độ tế bào, bào tử và nồng độ protein tinh thể sau 48 giờ lên men. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và bảng 3.9
phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể Chất hữu cơ bổ sung Nồng độ (g/lít) Mật độ Nồng độ protein tinh thể (mg/l) TCC(x108 CFU/ml) SC(x108 CFU/ml) Cám gạo 1 1,9 1,7 419 ±10 3 4,9 4,7 467±10 Cám ngô 1 1,8 1,3 422 ±11 3 2,5 2,3 431±09 Bột đậu tƣơng 1 3,0 1,9 421 ±09 3 5,6 5,2 474±11 MTCS 8,5 8,3 531±10 DTPBB 1,5 1,3 420±11
Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ bổ sung vào dịch thủy phân bã bia trên bảng 3.8cho thấy cám gạo và bột đậu tƣơng là hai yếu tố có tác động tích cực đến sinh trƣởng cũng nhƣ sự tạo thành tinh thể độc của chủng vi khuẩn MSS8.4. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồi Trâm và các cộng sự thì bột đậu tƣơng là nguồn dinh dƣỡng tốt nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn B. thuringiensis sinh độc tố diệt sâu (Nguyễn Hoài Trâm, 2004). Kết quả này cũng phù
hợp với kết quả cơng bố của Nguyễn Thị Hịa và các cộng sự thì khi bổ sung cám gạo và bột đậu tƣơng vào dịch thủy phân bùn thải sinh học làm môi trƣờng lên men vi khuẩn Btk thu độc tố diệt trừ sâu (Hoa và cộng sự, 2014).Trong hai nguồn dinh dƣỡng cám gạo và bột đậu tƣơng thì bột đậu tƣơng có khả năng tan tốt hơn, do vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia.
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể
Cơ chất bổ sung Nồng độ (g/l) Mật độ Nồng độ protein tinh thể (mg/l) TCC (x108CFU/ml) SC (x108CFU/ml) MgSO4.7H2O 0,1 1,9 1,7 432±11
Cơ chất bổ sung Nồng độ (g/l) Mật độ Nồng độ protein tinh thể (mg/l) TCC (x108CFU/ml) SC (x108CFU/ml) 0,5 2,2 1,9 469±10 CaCl2 0,1 1,8 1,5 415±12 0,5 2,1 1,9 429±11 NaCl 0,1 2,0 1,8 440 ±11 0,5 1,7 1,3 435±12 KH2PO4 0,1 2,2 2,1 442 ±9 0,5 1,9 1,8 439±10 K2HPO4 0,1 1,5 1,4 438 ±9 0,5 1,7 1,5 431±10 MnSO4 0,01 1,9 1,8 441±11 0,05 1,8 1,7 461±12 Môi trƣờng MTCS 4,5 4,3 531±10 DTPBB 1,5 1,3 420±11
Sau khi tổng hợp, phân tích và xử lý số liệu nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn khoáng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4 trên nền môi trƣờng là dịch thủy phân bã bia cho thấy: khơng có sự khác biệt về mật độ tế bào, mật độ bào tử trong dịch lên men ở các thí nghiệm có bổ sung và khơng có bổ sung thêm một số muối khoáng (bảng 3.9). Những sai khác về số lƣợng tế bào, bào tử ở các thí nghiệm có bổ sung và không bổ sung muối khống khơng có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhƣ vậy, việc bổ sung thêm muối khoáng ở các nồng độ nghiên cứu có vẻ khơng ảnh hƣởng gì đến sinh trƣởng của vi khuẩn MSS8.4 nếu chỉ xem xét ở góc độ mật độ tế bào và bào tử sau 48 giờ lên men.
Khi xem xét hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men MSS8.4 sau 48 giờ ni cấy cho thấy: có một sự khác biệt rõ rệt khi bổ sung thêm muối MgSO4.7H2O và MnSO4 vào dịch thủy phân bã bia. Ở hai thí nghiệm có bổ sung 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 0,05 g/l MnSO4 hàm lƣợng protein tinh thể thu đƣợc sau 48 giờ lên men tăng khoảng 10% so với thí nghiệm đối chứng là dịch thủy phân bã bia, hàm lƣợng deta endotoxin lần lƣợt đạt 469 mg/lít và 461 mg/lít (bảng 3.9).Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Braun năm 2000, Icgen và các cộng sự khi nghiên cứu về vai trò của Mg2+ trong sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể. Các tác giả này đã chỉ ra rằng sự thiếu hụt của Mg2+ trong môi trƣờng lên men sẽ làm giảm khả năng sinh trƣởng, hình thành bào tử trong dịch lên men, nhƣng ảnh hƣởng lớn nhất phát hiện đƣợc là giảm khả năng tổng hợp độc tố protein tinh thể. Mg2+ là trung tâm điều khiển hoạt động của enzym, sự có mặt của Mg sẽ tác động đến quá trình hình thành bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể (Braun S, 2000; Icgen và cộng sự, 2002)
Kết quả nghiên cứu trên bảng 3.9 cho thấy Mn2+ là một trong hai yếu tố ảnh hƣởng mạnh đến khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Ozkan và các công sự khi cho rằng Mn là yếu tố chủ trốt tác động đến quá trình sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis mà không ảnh hƣởng tới quá trình khác của tế bào (Ozkan và cộng sự, 2003). Theo nghiên cứu của Subbiahvà các cộng sự khi nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt muỗi từ vi khuẩn
B. thuringiensis subsp. israelensis việc bổ sung Mn2+ vào môi trƣờng dinh dƣỡng làm từ lông vũ đã làm tăng đáng kể hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch canh trƣờng lên men Bti (Subbiah và cộng sự, 2012).
Qua các kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 3.8 và 3.9 cho thấy: dịch thủy phân bã bia chƣa cung cấp đủ nhu cầu dinh dƣỡng cân đối và hợp lý cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể. Việc bổ sung thêm chất dinh dƣỡng hữu cơ không những chỉ làm tăng khả năng sinh trƣờng mà còn đồng thời làm tăng hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men. Các chất khoáng là những nhân tố hết sức quan trọng trong lên men vi khuẩn MSS8.4, chúng là các nhân tố ảnh hƣởng hƣởng trực tiếp đến sản phẩm của quá trình lên men.
Dựa vào các kết quả nghiên cứu ở trên, bột đậu tƣơng, MgSO4.7H2O và MnSO4 là các nhân tố đƣợc lựu chọn làm nhân tố dinh dƣỡng để hồn thiện mơi trƣờng lên men vi khuẩn MSS8.4 trên nền môi trƣờng cơ sở từ dịch thủy phân bã bia.
3.3.2.2. Đánh giá tác động độc lập của yếu tố đã chọn đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp detlta endotoxin của MSS8.4
Muối khoáng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp các sản phẩm phụ trong quá trình lên men vi sinh vật. Ở nồng độ thích hợp, sự có mặt của một số muối khoáng sẽ kích thích sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bt, nhƣng ở nồng độ quá cao nó lại có thể gây ức chế sinh trƣởng hoặc có thể tiêu diệt vi sinh vật. Do vậy, cần phải xác định nồng độ phù hợp cho từng chủng vi sinh vật cụ thể. Các thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mục 2.3.16.4(chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu). Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trên hình 3.23, hình 3.24.
Hình 3.23. Ảnh hƣởng của nồng độ MgSO4 đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4
Hình 3.24. Ảnh hƣởng của nồng độ MnSO4 đến khả năng tổng hợp protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4
- Ảnh hƣởng của muối MgSO4: cũng giống nhƣ kết quả khi khảo sát ảnh hƣởng của nguồn khoáng bổ sung, khi bổ sung thêm muối Mg trong một giới hạn cho phép không làm tăng đáng kể mật độ tế bào, bào tử của chủng MSS8.4 trong canh trƣờng lên men. Các chất khoáng khi bổ sung vào dịch thủy phân bã bia chủ yếu tác động đến khả năng sinh tổng hợp độc tố của chủng MSS8.4. Theo kết quả thí nghiệm trình bày trên hình 3.23 MgSO4 có ảnh hƣởng tích cực đến lên men vi khuẩn MSS8.4 trong khoảng từ 0 - 0,5g/l, khi nồng độ MgSO4 bổ sung vào dịch thủy phân bã bia tăng trên 1g/l nó đã bắt đầu ảnh không tốt đến sự sinh trƣởng cũng nhƣ khả năng sinh tổng hơp protein tinh thể của MSS8.4. Ở nồng độ 2 g/l MgSO4 hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men giảm xuống chỉ còn khoảng 50% so với thí nghiệm khơng bổ sung MgSO4(hình 3.23).Điều này cũng phù hợp với nhận
định của của Icgen và các cộng sự. Trong đó, hiệu quả sinh trƣởng, hình thành bào