CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis
1.5.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B.thuringiensis
Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT đƣợc thực hiện trên cơ sở phƣơng pháp lên men chìm (submerge fermentation) và lên men bề mặt: bao gồm lên men trên môi trƣờng xốp (soft medium) hoặc bán rắn (semisolid medium). Trong quá trình lên men ngƣời ta cung cấp các chất dinh dƣỡng thích hợp cho vi sinh vật sinh trƣởng, phát triển để nhận đƣợc sản phẩm của quá trình trao đổi chất.
1.5.2.1. Phương pháp lên men bề mặt
Dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có hoặc khơng có khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các hạt cơ chất này có thể đóng vai trò làm nguồn chất dinh dƣỡng, ví dụ nhƣ cám lúa mì, bột ngơ, bánh hạt bơng loại dầu… hoặc chỉ đơn giản đóng vai trị nhƣ chất mang vô cơ. Ở phƣơng pháp này, vi khuẩn sẽ mọc trên bề mặt cơ chất và tiếp nhận ơxy của khơng khí để sinh trƣởng.
Chuẩn bị môi trƣờng lên men: để chuẩn bị môi trƣờng ni cấy vi khuẩn có độ thơng thống tốt, các loại ngun liệu khơng nên xay nghiền quá nhỏ mà nên xay vỡ thành các mảnh 1 – 3 mm, trộn thêm cám trấu hay mùn cƣa, bã mía… rồi trãi mỏng ra các khay.
Thực hiện: làm ẩm mơi trƣờng bằng nƣớc có pH 6,5 – 7,5, hấp vô trùng ở121oC khoảng 1h. Để nguội vệ nhiệt độ phòng, phun dịch giống đã chuẩn bị sẵn, đảo đều. Các khay lên men đƣợc đặt trong phịng ni có quạt hút, điều chỉnh nhiệt độ trong phịng lên men 28 – 35oC. Định kỳ đảo trộn khối môi trƣờng để vi khuẩn phát triển đều khắp.
Sau khi kết thúc nuôi cấy, thu gom sản phẩm ở các khay và sấy ở khơng khí nóng 40 – 450C để đạt độ ẩm dƣới 10%.
1.5.2.2.Lên men chìm
Đây là công nghệ lên men hiện đại, đạt hiệu quả cao. Trong đó, vi khuẩn đƣợc ni cấy trong các nồi lên men có thể tích lên đến vài chục mét khối. Đƣợc thổi khí qua máy nén trong điều kiện vơ trùng. Thiết bị đƣợc trang bị hệ điều khiển tự động cung cấp khí, nhiệt độ, điều chỉnh pH. Thời gian ni cấy khoảng 2 – 3 ngày. Mật độ tế bào trong dịch lên men có thể lên đến hàng tỷ trong 1 ml dịch nuôi cấy. Cơng nghệ lên men chìm bao gồm các cơng đoạn chính nhƣ sau:
Chuẩn bị giống vi sinh vật: giống phải đảm bảo là giống chuẩn có hoạt lực diệt sâu cao, khơng bị tạp nhiễm. Trƣớc khi đƣa vào sản xuất giống đƣợc hoạt hóa đảm bảo các tế bào đang ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh.
Chuẩn bị môi trƣờng lên men: môi trƣờng dinh dƣỡng phải đảm bảo cung cấp đầy đủ dƣỡng chất, đƣợc vô trùng và điều chỉnh pH về giá trị thích hợp (với hầu hết các chủng B. thuringiensis có pH thích hợp từ 6,5-7,5).
Lên men thu hồi sản phẩm: các thông số lên men nhƣ tốc đột hổi khí, tốc độ khuấy đƣợc cài đặt theo đặc tính của từng chủng vi sinh vật. Thời điểm kết thúc quá trình lên men đƣợc xác định là thời điểm 95% tế bào đã chuyển hóa thành bào tử và tinh thể độc.
Thu hồi sản phẩm (downstream processing): dịch ni cấy có thể đóng chai dùng trực tiếp ở dạng lỏng hay qua ly tâm thu sinh khối rồi thêm phụ gia, sấy…hoàn thành dạng bột.
Quy trình sản xuất chế phẩm BT bằng phƣơng pháp lên men chìm theo sơ đồ sau :
Hình 1.10. Quy trình sản xuất chế phẩm BTbằng phƣơng pháp lên men chìm
1.5.3. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trường và con người 1.5.3.1. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người
Tính đặc hiệu của độc tố sinh ra bởi vi khuẩn B. thuringiensis đối với cơn
trùng đích là một trong những tính trạng khiến chế phẩm BT trở thành thuốc trừ sâu sinh học lý tƣởng. Trên thực tế, các chủng B. thuringiensis khác nhau sản sinh ra
các protein độc đối với một số lồi cơn trùng nhất định. Độc tố của protein B. thuringiensis tƣơng tác trực tiếp với thụ thể. Chỉ những cơn trùng trong ruột có các
vị trí thụ thể đặc trƣng để protein độc tố có thể kết bám mới bị ảnh hƣởng bởi protein B. thuringiensis. Ngƣời và đại đa số các cơn trùng có ích khơng có các thụ
thể này.
Cục Bảo vệ mơi trƣờng Hoa Kỳ (US Environmental Protection Agency US- EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein B. thuringiensis đã đƣợc thử ở liều lƣợng cao. Theo Extension Toxicology Network 1999, “kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 ngƣời mỗi ngày ăn 1 gram B. thuringiensis thƣơng mại
trong vòng 5 ngày và trong các ngày khác nhau không gây ra chứng bệnh gì. Những ngƣời ăn 1 gram B. thuringiensis/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn tồn khơng bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”. Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trong điều kiện phịng thí nghiệm) (Extoxnet,1999).
1.5.3.2. Ảnh hưởng đến môi trường
Protein B. thuringiensis tồn tại không bền trong đất và đƣợc phân loại vào dạng bất động vì nó khơng có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nƣớc ngầm. Protein này không bền vững trong điều kiện đất axít và bị phân hủy nhanh chóng khi phơi dƣới ánh sáng mặt trời, dƣới tác động của tiaUV. Do vậy, sử dụng thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis để bảo vệ cây trồng hồn tồn khơng tác động xấu tới mơi trƣờng.
Ngày nay, các nhà khoa học không những sử dụng B. thuringiensis để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học mà còn chuyển gen B. thuringiensis vào cây trồng. Kết quả cho thấy, các cây chuyển gen có khả năng kháng sâu rất tốt. Để đánh giá tác động của cây chuyển gen B. thuringiensis, các chuyên gia đã tiến hành những
nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hƣởng của cây trồng B. thuringiensis đối với sinh vật đất và các lồi cơn trùng khác đƣợc xem là có ích trong nơng nghiệp. Kết quả cho thấy, cây chuyển gen B. thuringiensis không gây ra ảnh hƣởng bất lợi đối với các sinh vật đất, thậm chí ngay cả khi các sinh vật này đƣợc xử lý B. thuringiensis với liều lƣợng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều
kiện trồng trọt tự nhiên. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng cho thấy khơng có sự thay đổi nào trong quần thể visinh vật đất giữa các cánh đồng có nguyên liệu thực vật B. thuringiensis và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống (Donegan và
cộng sự, 1995)
1.5.4. Tồn dư của thuốc trừ sâu BT 1.5.4.1. Tồn dư trong nước
Có 2 phƣơng thức chính về sự tồn tại của thuốc trừ sâu sinh học trong tự nhiên: có sẵn trong môi trƣờng hoặc thông qua các hoạt động của con ngƣời, đặc biệt là hoạt động nông nghiệp, gồm các chủng vi sinh vật nhƣ B. thuringiensis, Coniothyrium minitans, Sclerotinia minor, và Chondrosterum purpureum (Szewczyk và cộng sự,2006; Chandler và cộng sự, 2011; Glare và cộng sự, 2012; Ntalli và Caboni, 2012).Tuy nhiên, với sự gia tăng sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu sinh học, các hoạt động của con ngƣời đang là nguyên nhân chính của tồn dƣ thuốc trừ sâu sinh học trong môi trƣờng nƣớc (Chandler và cộng sự, 2011). Sau khi đƣợc sử dụng để kiểm soát dịch hại, thuốc trừ sâu sinh học đƣợc chuyển hóa một phần nhờ vi sinh vật, phần lớn sẽ bị rửa trôi và vận chuyển đến các con sơng, hồ, đập. Đây là ngun nhân chính dẫn đến tồn dƣ của thuốc trừ sâu sinh học vào môi trƣờng nƣớc (Jorgensen và cộng sự, 2012; Rodrigues và cộng sự, 2013). Ô nhiễm nguồn nƣớc bởi thuốc trừ sâu sinh học có thể gây ra nhiều vấn đề đến sức khỏe con ngƣời, cũng nhƣ ảnh hƣởng đến các loài thủy sản (Plimmer, 1999; Raizada và cộng sự, 2001; Winkaler và cộng sự, 2007; Chandler và cộng sự, 2011). Một số nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để xác định sự vận chuyển của thuốc trừ sâu từ cây trồng vào suối (Douville và cộng sự, 2005; 2007; 2009; Deb và cộng sự, 2009).
Nồng độ của thuốc trừ sâu sinh học tìm thấy ở sơng, hồ phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tổng lƣợng đƣợc sử dụng, cũng nhƣ chu kỳ bán rã của thuốc trừ sâu sinh học, thời gian phân hủy. Thuốc trừ sâu sinh học có thể bị phân hủy bởi ánh sáng, phân hủy sinh học, hấp phụ và thủy phân (Cleveland và cộng sự, 2002; Thompson và cộng sự, 2004; Sanderson và cộng sự, 2007; Prihoda and Coats, 2008; Schleier và cộng sự, 2008; Totowa và cộng sự, 2009). B. thuringiensis đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một thuốc bảo vệ thực vật trong quản lý dịch hại tổng hợp. Douville và cộng
sự (2005) cho thấy, nội độc tố Cry1Ab của B. thuringiensis có chu kỳ bán rã 4 và 9 ngày tƣơng ứng trong nƣớc và đất.
1.5.4.2. Tồn dư trong đất
Khi thuốc trừ sâu sinh học đƣợc thải ra ngồi mơi trƣờng, nhiều quá trình nhƣ hấp phụ, bay hơi, chảy bề mặt, rửa trơi và phân hủy có thể xảy ra. Việc nghiên cứu tồn dƣ của thuốc trừ sâu sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp là cần thiết để đảm bảo an tồn thực phẩm và bảo vệ mơi trƣờng (Liang và cộng sự, 2011). Đất là bộ lọc tích cực, nơi mà các hợp chất hóa học có thể bị phân hủy bởi các q trình vật lý, hóa học, sinh học…sự tích tụ của thuốc trừ sâu sinh học trong đất phụ thuộc vào các đặc tính tổng thể của hệ sinh thái (Boesten và cộng sự, 1991). Hấp phụ và phân hủy là hai quá trình quan trọng để có thể đánh giá tồn dƣ của thuốc trừ sâu sinh học trong đất (Roberts và Hutson, 1999). Ví dụ, hấp phụ có thể làm giảm nồng độ của thuốc trừ sâu sinh học trong đất, giảm hoạt tính sinh học hoặc trạng thái di động, tăng khả năng phân hủy bởi vi sinh vật. Một vài nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để đánh giá tác động của thuốc trừ sâu sinh học trong đất và cộng đồng vi khuẩn đất. Bởi vì các chế phẩm này thƣờng không bền trong điều kiện thƣờng, hầu hết bị phân hủy bởi ánh sáng và oxy (Ujváry, 2001). Vậy tồn dƣ của chế phẩm B. thuringiensis trong đất xảy ra nhƣ thế nào? Việc tồn dƣ này có thể dẫn đến những
mối nguy hiểm với môi trƣờng nhƣ gây độc với các loài sinh vật khác, hoặc tăng tính kháng của vi sinh vật (Tapp và Stotzky, 1998). Hoạt tính của B. thuringiensis phụ thuộc vào từng loại đất và pH (ví dụ ở pH cao thì hoạt động của vi sinh vật là lớn hơn). Protein độc tố có khả năng gắn kết nhanh và chặt với đất sét, sự gắn này làm giảm độ hoạt động của protein, mặc dù protein gắn kết vẫn giữ lại hoạt tính sinh học (Stotzky, 2004). Hơn nữa, sự tồn tại của B. thuringiensis phụ thuộc vào
hoạt tính, hàm lƣợng, khả năng hoạt động, làm mất hoạt tính bởi ấu trùng cơn trùng, khả năng phân hủy của vi sinh vật đất, và sự phân hủy của các yếu tố vô sinh (Stotzky, 2004). Điều này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu tồn dƣ của B. thuringiensis, trong đất B. thuringiensis tƣơng tác yếu đi với sự hiện diện của các
tăng mối nguy cơ tạo nên các chủng kháng độc. Một chỉ số để đánh giá thời gian tồn tại của B. thuringiensis trong đất là thời gian để 50% độc tố biến mất (DT50), B. thuringiensis tồn tại trong đất ít nhất là 56 ngày (Sun và cộng sự, 2007). Trên
thực tế cho thấy rằng bào tử B. thuringiensis có thể tồn tại trong đất rừng lên đến 2-5 năm.
1.6. Bã malt bia
Bia là một loại nƣớc giải khát lên men rất bổ dƣỡng.Vì thế nhu cầu sản xuất bia ngày càng tăng lên đáng kể.Bên cạnh đó một số phụ phẩm trong ngành công nghiệp bia cũng tăng lên khá nhiều, nếu khơng có biện pháp xử lý sẽ gây lãng phí và ơ nhiễm mơi trƣờng
Bã bia (bã malt) chính là sản phẩm đƣợc tạo ra trong q trình dịch hóa và lọc dịch đƣờng. Trong q trình dịch hóa, dƣới tác dụng của các enzyme amylase, protease và các enzyme khác thì 65-70% vật chất khơ của malt sẽ chuyển vào dịch khi lọc, phần còn lại nằm trong bã malt.
Bảng 1.3. Thành phần bã malt (%)
Chỉ số Bã thô Bã sấy
Độ ẩm 76,3 9.0
Protein 6.63 25,5
Lipid 1.7 7,5
Chất hịa tan khơng có nito 9.72 37.3
Cenlulose 5.1 16,0
Tro 1.2 4.6
Nhiệt lƣợng bã (cal) 115 440 ( Densikow, 1963)
Bã malt tƣơi có dạng sệt sệt của các sản phẩm hạt nghiền thơ, có màu nâu nhạt, vị ngọt và mùi thơm của mạch nha. Hiệu suất bã malt ƣớt trung bình chiếm 115-130% trọng lƣợng hạt đƣa vào dịch hóa hoặc 2,3 tấn/1000dcl (decalit) bia thành phẩm. Phần bã còn chứa các chất dinh dƣỡng, các chất men và xác vi sinh vật. Vậy nên bã malt có mùi thơm và vị ngon. Hàm lƣợng khoáng, vitamin (chủ yếu
là vitamin nhóm B) và đặc biệt là hàm lƣợng đạm trong bã bia cao. Tùy thuộc vào phƣơng pháp tách và vận chuyển mà độ ẩm của bã malt dao động từ 75-85%, với độ ẩm này thì bã malt có dạng sệt, màu nâu nhạt vị ngọt và có mùi mạch nha.
Tro của bã malt giàu muối photpho, canxi, magie và hàm lƣợng của chúng phụ thuộc vào thành phần của nƣớc dùng để dịch hóa. Thành phần trung bình của tro nhƣ:
Bảng 1.4. Thành phần trung bình của tro
Thành phần Hàm lƣợng K2O 3,9 Na2O 0,5 CaO 11,9 MgO 11,5 P2O5 40,5 SiO2 25,3 (Densikow, 1963) Ứng dụng hiện nay của bã malt tƣơi và khơ là để làm thức ăn gia súc, có khả năng kích thích tạo sữa và thịt khá tốt, do đó nó đƣợc dùng là thức ăn cho bò sữa, trâu bò lợn,…Trên thế giới, bã malt bia đƣợc sử dụng phổ biến làm thức ăn cho chim, dê, cá,.. Ngồi ra bã malt bia cịn đƣợc sử dụng làm phân hữu cơ, làm nguyên liệu để trồng nấm. Tại New Zealand nhà máy bia DB Export tuyên bố đã chế tạo thành công xăng sinh học mang tên "Brewtroleum" bằng cách tận dụng bã bia. Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu tận dụng bã bia để làm để làm nƣớc chấm lên men.
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1. Vật liệu
2.1.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 2.1.1.1 Mẫu đất, lá dùng cho phân lập 2.1.1.1 Mẫu đất, lá dùng cho phân lập
286 mẫu đất và 31 mẫu lá đƣợc sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn B.
thuringiensis đƣợc thu thập từ các vùng Điện Biên, Hà Nội, Nghệ An, Nha Trang
(Khánh Hòa), Lâm Đồng, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang. Những khu vực lấy mẫu này chƣa đƣợc sử dụng bất kỳ một loại chế phẩm BT nào. Những mẫu đất, lá này nằm trong bộ sƣu tập của Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học .
2.1.1.2. Bã malt bia
Bã malt bia đƣợc lấy từ nhà máy bia Sài Gịn- Hà Nội thuộc khu cơng nghiệp vừa và nhỏ quận Bắc Từ Liêm.
2.1.1.3. Côn trùng thử nghiệm
Ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) tuổi 2; ruồi đục quả (Tephritidae) đƣợc cung cấp từ bộ môn Côn trùng-Viện Bảo vệ thực vật.
Ấu trùng muỗi Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus
do Viện sốt rét ký sinh trùng Trung ƣơng cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α dùng cho tách dòng gen và chủng vi khuẩn E.coli BL21 dùng để biểu hiện gen của hãng Invitrogen.
Chủng B.thuringiensis 4D4 có nguồn gốc từ Bộ sƣu tập Bacillus thuringiensis của đại học Colombus, bang Ohio, Hoa Kỳ
2.1.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector
Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Cặp mồi khuếch đại gen cry2A đƣợc thiết kế dựa trên các đoạn trình tự bảo thủ của gen cry2A đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen (GenBank).
Tên mồi Trình tự Vị trí nhận biết Kích thƣớc (bp)
Cry2AaF TAAGGATCCGATGAATAATGTATTGAATAGTGGAAGA BamHI 1902
Cry2AaR ATTCTCGAGATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGG XhoI
Hệ vector
Vector pET22b (+) của hãng Novagen, vector pGEM-T mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega, TA Cloning® Kit with pCR™2.1 vector (Thermosciencetific) do Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Cơng nghệ Sinh học cung cấp.
2.1.4. Hóa chất
Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Cao thịt, Pepton, Trypton, cao men, agar
Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin axit, fushin bazơ.
Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris- base, TAE, loading dye 6x.
Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, đệm, nƣớc khử ion, Taq
DNA polymerase, DNA khuôn.
2.1.5. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật và Phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học, gồm có: máy chạy PCR (PTC-100,Mỹ), bộ điện di DNA (Thụy Điển), máy soi gel (Vilber Lourmat, Đức), máy chụp ảnh gen (Gen Doc pharmacia), máy li tâm, kính hiển vi đối pha (Nicon, Nhật Bản), máy Vortex (Olympus, Nhật), máy đông khô (Đức), tủ lạnh sâu -86 0C, Panasonic - Nhật, lị vi sóng, tủ ấm (Frigor, Đan Mạch), máy lắc ổn