CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vikhuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng
Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các loài phụ B. thuringiensis khác nhau. Một số nghiên cứu về mối tƣơng quan giữa sự có mặt của plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng. Các phƣơng pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dịng gen đã chứng minh rằng các gen mã hố protein diệt cơn trùng thƣờng nằm trên các plasmid lớn có số bản sao thấp. Theo kết quả nghiên cứu của Carlton và Gonzalez, plasmid có mặt trong hầu hết các chủng B. thuringiensis, số lƣợng plasmid dao động từ 2 đến 12 trong
các chủng nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào B. thuringiensis. Ví dụ các plasmid trong B. thuringiensis. aizawai và kurstaki HD-1 có 5 gen mã hóa protein diệt cơn trùng nằm ở nhiều vị trí khác nhau trong tế bào (Ngơ Đình Bínhvà cộng sự, 2002; Ereclus và cộng sự, 1994).
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển B. thuringiensis có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt (cytolysin) và Vip (vegetative insecticidal protein). Dựa vào tính tƣơng đồng của trình tự axit amin các họ độc tố này lại đƣợc chia thành các lớp khác nhau. Cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ đƣợc quy ƣớc nhƣ sau: họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1, 2, 3...), ký tự viết hoa (A, B...), ký tự viết thƣờng (a, b...), ví dụ nhƣ độc tố Cry12Aa1. Dựa vào tƣơng đồng vềaxit amin, các lớp độc tố đƣợc chia thành: lớp 1 (Cry1, Cry2...) có độ tƣơng đồng dƣới 45%, lớp 2 có độ tƣơng đồng 45%-78%, lớp 3 có độ tƣơng đồng 78%-95%, lớp 4 có độ tƣơng đồng dƣới 99% (Burges 2001; Crickmore và cộng sự, 1998; Kronstad và cộng sự, 1986). Ngoài 3 độc tố nêu trên
B. thuringiensis còn sinh ra một số độc tố khác nhƣ hemolysin, enterotoxin,
chitinase, phospholipase....
Độc tố Cry
Độc tố Cry hay nội độc tố δ mã hóa bởi các gen cry, đƣợc tiết ra bởi các vi khuẩn Gram dƣơng B. thuringiensis, và đƣợc sử dụng để kiểm soát dịch hại cho cây trồng, do những đặc trƣng và độc tính của chúng với những loại cơn trùng cụ thể. Tính đến năm 2016, gen cry đã đƣợc phát hiện là 780 gen
(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html), tƣơng ứng với hơn 70 nhóm protein khác nhau. Sự đa dạng đặc biệt của độc tố Cry đƣợc cho là sự linh hoạt của di truyền. Nhiều gen cry đƣợc liên kết với yếu tố chuyển vị có thể đƣợc khuếch đại nhằm tạo ra các gen độc tố mới (de Maagd và cộng sự, 2001). Thêm vào đó, phần lớn các gen cry đƣợc tìm thấy trên plasmid và sự di truyền chéo bởi tiếp hợp có thể tạo nên nhiều chủng mới mang gen cry mới (Thomas và cộng
sự, 2000; 2001). Số lƣợng lớn các dữ liệu về protein Cry tạo điều kiện thuận lợi cho việc so sánh, phân tích cũng nhƣ làm sáng tỏ tính gây độc và tính đặchiệu với cơn trùng.
Năm 1989, những chi tiết đầu tiên của chuỗi protein Cry đƣợc phân tích(Hưfte và Whiteley, 1989).Tại thời điểm đó, 13 mẫu gốc của protein Cry đƣợc biết đến và đƣợc phân loại vào 4 nhóm dựa trên khả năng diệt cơn trùng của chúng. Kết quả so sánh trình tự axit amin cho thấy các protein Cry có tính đa dạng cao. Tuy nhiên, những đoạn trình tự bảo thủ mang 5 axit amin đã đƣợc phát hiện ở nhiều protein Cry (Lopez-Meza and Ibarra, 1996; Soberon và cộng sự, 2010; Ammons và cộng sự, 2013). Hầu hết các độc tố Cry1- Cry31có một số hoặc tất cả 5 trình tựaxit amin bảo thủ. Những đoạn trình tự bảo thủ này có thể đóng vai trị quan trọng đối với tính ổn định và chức năng của các độc tố (Höfte và Whiteley, 1989; Craig và David, 2007).
Độc tố Cry nói chung có 1 trong 2 kích thƣớc: 130-140 kDa hoặc khoảng 70 kDa.
Sử dụng miền thông tin bắt nguồn từ cấu trúc tinh thể của Cry1Aa, Cry2Aa và Cry3Aa, de Maagd và cộng sự đã sắp xếp 3 vùng độc tố riêng biệt và tạo cây phân loại để đánh giá sự đóng góp của từng miền vào đặc tính diệt cơn trùng. Các loại cây khác nhau đều đƣa ra một kết luận chung, đó là có sự tƣơng quan giữa tƣơng đồng trình tự và khả năng diệt côn trùng. Tuy nhiên những cụm không tƣơng đồng đơi khi cũng có hoạt tính tƣơng tự. Điều này cho thấy khả năng diệt cơn trùng có thể phát triển theo hƣớng tiến hóa. So sánh các cây phân loài khác nhau cho thấy vùng I và vùng II có cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Ngƣợc lại, các cấu trúc liên kết của vùng III là khá khác nhau. Do đó có thể kết luận sự sai khác này đóng góp vào sự đa dạng của độc tố Cry (de Maagd và cộng sự, 2001).
Cấu trúc 3 vùng của độc tố Cry đã đƣợc nghiên cứu để đƣa ra những hiểu biết đáng kể về cơ chế, chức năng gây độc, và góp phần giải thích về tính đặc hiệu diệt côn trùng. Cho đến nay, 7 cấu trúc đã đƣợc nghiên cứu bằng tinh thể học tia X: Cry1Aa, Cry1Ac, Cry2Aa (Morse và cộng sự, 2001), Cry3Aa (Li và cộng sự, 1991), Cry3Ba (Galitsky và cộng sự, 2001), Cry4Aa (Boonserm và cộng sự, 2006),
và Cry4Ba (Boonserm và cộng sự, 2005). Mặc dù có sự đa dạng về trình tự axit amin, tất cả các protein Cry đều có cấu trúc bậc 3 tƣơng tự nhau nhƣ đã đƣợc phân tích dựa trên cấu trúc tinh thể bằng X-ray của Cry1Aa, Cry2Aa, Cry3Aa, Cry3Bb, Cry4Aa and Cry4Ba. Đầu C của độc tố liên quan đến sự hình thành tinh thể nhƣng khơng nằm trong độc tố trƣởng thành. Đầu C này bị cắt bỏ trong ruột của côn trùng. Đầu N là độc tố gồm 3 vùng I, II và III (Boonserm và cộng sự, 2006) (Bảng 1.1, Hình 1.2).
Bảng 1.1. Phân tích trình tự của độc tố Cry đại diện với cấu trúc đƣợc nghiên cứu bằng tinh thể tia X (Boonserm và cộng sự, 2006)
Độc tố Côn trùng đặc trƣng Tổng tồn dƣ % Tƣơng đồng trình tự Các vùng bảo thủ 1Aa 2Aa 3Aa 4Ba
Cry1Aa Lepidoptera 577 23 39 30 1, 2, 3, 4, 5
Cry2Aa Diptera/
Lepidoptera 584 21 20 1, 2
Cry3Aa Coleoptera 584 36 1, 2, 3, 4, 5
Cry4Ba Diptera 558 1, 2, 3, 4, 5
Vùng I, đƣợc mô tả lần đầu tiên trong Cry3Aa bởi Li và cộng sự (Li và cộng sự, 1991). Vùng này đƣợc tạo thành bởi cấu trúc xoắn α trong đó 6 cấu trúc xoắn bao quanh một chuỗi xoắn trung tâm. Cấu trúc xoắn bên ngoài là cấu trúc lƣỡng cực trong tự nhiên, có thể ƣa nƣớc hoặc kỵ nƣớc. Nhóm phân cực nằm bên trong cấu trúc xoắn. Hầu hết các xoắn dài hơn 30 Å và dó đó sẽ có khả năng kéo dài thành một màng kỵ nƣớc. Các đặc điểm này tƣơng tự cấu trúc hình thành lỗ rỗng của colicin (một loại độc tố của E. coli) (Parker và cộng sự, 1989) dẫn đến giả thuyết cho rằng, vùng I quyết định sự hình thành lỗ rỗng trong độc tố Cry (Li và cộng sự, 1991).
Hình 1.2. Cấu trúc tinh thể của Cry1Aa, Cry2Aa (Morse và cộng sự, 2001), Cry 3Aa(Galitsky và cộng sự, 2001), và Cry4Ba (Boonserm và cộng sự, 2006).
(Vùng I, II, III tương ứng là đỏ, xanh lá và xanh dương. Đầu N của Cry2Aa được thể hiện màu vàng)
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của colicin N
(Vùng I được thể hiện màu đỏ)
Vùng II, đƣợc hình thành bởi 3 tấm β đối song song đƣợc gấp gọn lại với nhau để tạo thành cấu trúc lăng trụ(Li và cộng sự, 1991). Hai trong số các tấm đƣợc bao bọc bởi bốn chuỗi nhƣ mơ hình “Greek key” và tiếp xúc với dung mơi. Tấm thứ 3 ngƣợc lại với vùng I, là một cấu trúc tƣơng tự mô hình “Greek key” với ba chuỗi và một cấu trúc xoắn α ngắn.Về mặt cấu trúc, vùng II thay đổi hầu hết các vùng độc tố (Boonserm và cộng sự, 2005). Điều này đặc biệt đúng với các vòng (loop) đỉnh, trong đó có sự khác biệt đáng kể trong chiều dài, cấu tạo và trình tự. Độ dài của
chuỗi cũng rất thay đổi, điển hình nhƣ của cry2Aa và cry4Ba. Do những biến động này, vùng II đƣợc cho là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của độc tính. Cấu trúc vùng II đã đƣợc so sánh với các protein lăng trụ khác (de Maagd và cộng sự, 2003; Shimizu và cộng sự, 1994; Sankaranarayanan và cộng sự, 1996; Lee và cộng sự, 1998).
Vùng III có chứa hai cuộn xoắn, các tấm β đối song song tạo thành một kẹp β (β-sandwich) hình học topo gọi là “jelly roll”, tham gia vào việc gắn thụ thể (Li và cộng sự, 1991). Hai tấm đƣợc sắp xếp thành năm chuỗi, với bề mặt tấm ngồi tiếp xúc với dung mơi, tấm trong ngƣợc lại với vùng II. Hai vòng (loop) kéo dài từ một đầu của vùng, và tƣơng tác với vùng I (Grochulski và cộng sự, 1995). Vùng III cho thấy ít có biển đổi về cấu trúc hơn ở vùng II, sự khác biệt chính đƣợc tìm thấy ở độ dài, hƣớng, và trình tự các vịng (Boonserm và cộng sự, 2005). Điểm khác biệt quan trọng này rõ rệt nhất với cry1Aa và cry1Ac, với vòng lặp đƣợc mở rộng trong
cry1Aa tạo thành nơi bám với thụ thể bám (Burton và cộng sự, 1999; Derbyshire và cộng sự, 2001; Li và cộng sự, 2001). Vùng III đã đƣợc so sánh ở một số loại protein khác nhau (de Maagd và cộng sự, 2003), nhƣng nó tƣơng đồng so với cấu trúc bám của carbohydrate (CBMs) đƣợc tìm thấy trong hydrolases glycoside hydrolases của vi sinh vật với đặc tính nổi bật là lyase, và esterase. Các enzyme này thƣờng có một vùng xúc tác liên kết với một hoặc nhiều CBM. Chức năng của các CBM là xúc tác cho chất nền polysaccharide của nó (Tunnicliffe và cộng sự, 2005). Điều này giúp tăng cƣờng hiệu quả xúc tác của enzyme bằng cách tăng nồng độ chất nền.
Đặc điểm một số nhóm độc tố Cry
Nhóm Cry1: gồm trên 130 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A - Cry1L có khối lƣợng 130kDa, có hoạt tính chống lại các lồi thuộc bộ cánh vảy (Takashi và Gary, 1993).
Nhóm Cry2: gồm hơn 20 độc tố thuộc nhóm Cry2A. Các protein nhóm này có khối lƣợng 70kDa, có độc tính với cả hai loài bộ cánh vẩy và bộ hai cánh.Riêng Cry2B và Cry2C tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ cơn trùng cánh vẩy (Takashi và Gary, 1993).
Nhóm Cry3: gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A - Cry3C có trọng lƣợng 73kDa, có hoạt tính chống lại các lồi thuộc bộ cánh cứng (Takashi và Gary, 1993).
Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A - Cry4B tích lũy cả hai loại tinh thể có khối lƣợng khoảng 70kDa và 130kDa. Nhóm này có hoạt tính với các lồi thuộc bộ hai cánh. Những protein này cùng với protein 27 kDa do nhóm Cyt1A tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn (Takashi và Gary, 1993).
Nhóm Cry5: protein Cry5 có trọng lƣợng 81kDa, gây độc với côn trùng bộ cánh vảy và cánh cứng (Dwu và cộng sự, 1991).
Nhóm Cry8: các protein Cry8 mã hóa bởi nhóm gen cry8 có hoạt lực đối với cơn trùng thuộc bộ cánh cứng. Cho đến hiện tại, những nghiên cứu về gen cry8 vẫn còn rất mới và chƣa đƣợc đầy đủ. Đến nay đã có 39 gen thuộc các dƣới loài B. thuringiensis khác nhau của nhóm gen này đã đƣợc xác định. Gen cry8Aa1, cry8Ba1 đƣợc tách dòng từ B. thuringiensis var. kumamotoensis. Gen cry8Ea1, cry8Fa1, cry8Ha1 đƣợc tách dòng từ B. thuringiensis 185. Gen cry8Da đƣợc tách
dòng từ B. thuringiensis var. galleriae. Gần đây, một số gen cry8 mới đƣợc xác
định nhƣ gen cry8Ia1 (Yan và cộng sự, 2008), cry8Ea2 (Liu và cộng sự, 2007). Hầu hết các gen cry8 có khối lƣợng phân tử là 130 kDa (Thanh và cộng sự, 2009; Thanh và cộng sự, 2011; Thanh và cộng sự, 2012).
Hình 1.4. Tóm tắt phổ hoạt tính của B. thuringiensisδ-endotoxins (Cry và Cyt)(Palma và cộng sự, 2014). Cyt)(Palma và cộng sự, 2014).
Độc tố Cyt
Độc tố Cyt (độc tố phân hủy tế bào) cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi nhƣ độc tố Cry, nhƣng tính tƣơng đồng của trình tự axit amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry hầu nhƣ không đáng kể. Độc tố Cyt đầu tiên đƣợc Waalwijk phát hiện là Cyt1Aa1 vào năm 1985. Hiện nay 22 độc tố Cyt thuộc 2 nhóm đã đƣợc phát hiện. Các độc tố này có khối lƣợng 25-30 kDa và có thể làm tăng khả năng diệt cơn trùng của độc tố Cry (Nguyễn Xuân Cảnhvà cộng sự, 2004; Trịnh Thị Thu Hàvà cộng sự, 2013).
Có một số protein diệt sâu khơng liên quan đến protein Cry đƣợc tạo ra ở một số chủng B. thuringiensis trong pha sinh trƣởng sinh dƣỡng của tế bào, các protein này gọi chung là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) do gen vip mã hóa tổng hợp. Các độc tố Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào (Tien và cộng sự, 2013).
Cho đến nay, có 2 nhóm Vip đã đƣợc mơ tả. Nhóm thứ nhất là hệ hai thành phần có chứa 2 protein Vip1 and Vip2, có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 100 kDa và 52 kDa. Những protein này có hoạt tính đối với một số loài bọ cánh cứng (Warren, 1997). Nhóm thứ hai gồm 1 protein có khối lƣợng phân tử 88,5 kDa. Vip3 đƣợc tổng hợp trong suốt pha sinh sinh dƣỡng và không đƣợc tiết ra ngồi. Protein này có hoạt tính đối với phổ rộng các lồi cơn trùng cánh vảy nhƣ Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea. Khi côn trùng thuộc
các nhóm này ăn phải độc tố sẽ bị bphân giải các tế bào biểu mô ruột giữa và chết (Kronstad và cộng sự, 1986; Lee và cộng sự, 2003). Trình tự protein của 2 nhóm này khơng có sự tƣơng đồng với các protein Cry (Warren, 1997; Osman và cộng sự, 2013). Cho đến nay, có khoảng 82 gen mã hóa protein Vip đã đƣợc phân lập và tách dịng. Những gen này có thể đƣợc phân loại thành 3 nhóm 8 dƣới nhóm theo sự tƣơng đồng về trình tự (http://www.lifesci.sussex. ac.uk/home/Neil_Crickmore/B.
thuringiensis/vip.html/) (Osman và cộng sự, 2015).
1.1.5.2. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng
Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng liên quan đến sự hòa tan của tinh thể trong ruột giữa côn trùng sau khi côn trùng tiêu hóa B. thuringiensis
(Whalon và Wingerd, 2003). Quá trình phân giải protein của tiền độc tố nhờ protease ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion (Hình 1.5). Tinh thể bao gồm các tiền độc tố, để tiền độc tố trở nên hoạt động thì cơn trùng mẫn cảm phải ăn chúng. Với hầu hết côn trùng cánh vảy, tiền độc tố đƣợc hịa tan trong mơi trƣờng kiềm của ruột giữa côn trùng (Chicott và cộng sự, 1993). Sự khác nhau trong phạm vi hòa tan đơi
khi giải thích sự khác nhau về cấp độ gây độc trong số các protein Cry. Sau khi hòa tan nhiều tiền độc tố bị thủy phân bởi protease ở ruột giữa côn trùng để trở thành dạng độc tố hoạt động. Protease chính của ruột giữa côn trùng cánh vảy giống trypsin hoặc chymotrypsin.
Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng
(a) Tinh thể độc bị hòa tan bởi dịch ruột; (b) Protease ruột cắt từ đầu C của protein độc tố; (c) Tạo ra độc tố đƣợc hoạt hóa với hoạt động của vùng 2 và 3; (d) Vùng I sắp xếp 2 chuỗi xoắn cho phép gắn vào màng; (e) Hình thành lỗ màng (Grochulski và cộng sự, 1995).
Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng là sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ màng (kênh ion):
Sự gắn kết của độc tố với thụ thể:Sự gắn kết của độc tố với thụ thể của tế bào ruột cơn trùng là q trình phức tạp. Đó là sự gắn kết của độc tố với thụ thể (phân tử cảm thụ) nằm trên màng vi thể của tế bào ruột côn trùng. Nhiều bằng chứng cho thấy các độc tố Cry có khả năng gắn kết với một hoặc nhiều thụ thể trên bề mặt tế bào. Q trình glycosyl hóa đóng vai trị quan trọng trong tƣơng tác giữa độc tố và thụ thể (Jurat-Fuentes và cộng sự, 2002).
Sự hình thành kênh ion: Cấu trúc của độc tố bao gồm vùng I với bộ bó 7 chuỗi xoắn alpha. Vùng này có chức năng bám vào màng ruột cơn trùng và hình thành các lỗ rị (kênh ion). Hill và cộng sự cho rằng kênh ion giống nhƣ lỗ rị đại phân tử, có
tính chất nhƣ một kênh khơng chọn lọc, các ion Na+ và K+ đi qua (Canh và cộng sự, 2004).
Ngồi ra, cơ chế diệt cơn trùng của độc tố Cry1Ab đƣợc cho là do sự gắn kết của độc tố Cry1Ab vào thụ thể BT-R1 cảm ứng tín hiệu phân tử kích thích protein G và adenylyl cyclase dẫn đến tăng hàm lƣợng cAMP trong tế bào (Zhang và cộng sự, 2006). Phân tử cAMP hoạt hóa protein kinase A, gây ra nhiều sự biến đổi trong tế bào, bao gồm sự sắp xếp lại bộ khung tế bào và dịng ion. Q trình này dẫn đến sự thay đổi hóa học của tế bào và làm tế bào chết). Cơ chế gây chết tế bào còn liên