Phương án theo mơ hình Nồng độ bổ sung (g/l) Mật độ (CFU/ml) Nồng độ protein tinh thể (mg/l) MnSO4 MgSO4 BĐT TCC SC Thực nghiệm Mơ hình 2 0,05 0,45 3,00 4,5x108 4,3x108 529,11±11 525 16 0,076 0,221 3,47 2,8x108 1,3x108 509,24±10 513 38 0,051 0,337 2,292 3,3x108 3,1x108 515,2±10 519 47 0,009 0,237 1,487 1,25x107 1,07x107 457±11 471 90 0,056 0,581 3,093 4,15x108 3,8x108 527,93±10 526
ĐC (MT bã bia thủy phân) 1,7x108 1,5x108 431±10 - Môi trƣờng MTCS 5,10x108 4,5x108 530,14±12 -
Kết quả phân tích hàm lƣợng protein ở các thí nghiệm cho thấy khơng có sự khác biệt lớn giữa kết quả dự đốn của mơ hình và thực nghiệm. Theo kết quả tính tốn của mơ hình, phƣơng án 2 (Bảng 1 phụ lục 2) là phƣơng án cho hàm lƣợng protein tinh thể cao nhất đạt 525 mg/l. Kết quả thực nghiệm (Bảng 3.12) cũng cho thấy đây là phƣơng án cho nồng độ protein tinh thể cao nhất trong các phƣơng án thí nghiệm. Nhƣ vậy, phƣơng án tối ƣu cho lên men vi khuẩn MSS8.4 từ bã bia đƣợc chọn là phƣơng án 2 với thành phần cụ thể nhƣ sau: Dịch thủy phân bã bia (2,5%TS) + 0,05 g/l MnSO4+ 0,45 g/l MgSO4.7H20 + 3 g/l bột đậu tƣơng. Khi đối chiếu với kết quả nghiên cứu đánh giá các yếu tốt độc lập cho thấy: MnSO4 nếu bổ sung trực tiếp vào mơi trƣờng bã bia mà khơng có mặt của các yếu tố khác nhƣ bột đậu tƣơng và MgSO4.7H2O thì ở nồng độ 0,05 g/l nó đã bắt đầu ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn MSS8.4. Nhƣng khi có sự tƣơng tác của bột đậu tƣơng và
MgSO4 thì đây lại là nồng độ giúp kích thích sự sinh trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp protein tinh thể. Hai yếu tố còn lại là bột đậu tƣơng, MgSO4.7H2O vẫn nằm trong khoảng có tác động tốt đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4. Nhƣ vậy, để tạo môi trƣờng lên men cho vi sinh vật cần có sự xem xét đến yếu tố tác động cộng hƣởng để có đƣợc kết quả tốt nhất.
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.12 cũng cho thấy: Sau khi mơi trƣờng đƣợc tối ƣu hóa bằng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt, hiệu suất lên men tăng lên đáng kể đặc biệt là nồng độ protein tinh thể. Mật độ tổng tế bào, bào tử và nồng độ protein tinh thểở dịch canh trƣờng lên men sau khi môi trƣờng đã đƣợc tối ƣu lần lƣợt đạt 4,5x108CFU/ml, 4,3x108CFU/ml và 529,11 mg/l so với trƣớc tối ƣu là 1,7x108 CFU/ml, 1,5x108 CFU/ml và 431 mg/l. Nhƣ vậy, sau khi tối ƣu môi trƣờng lên men bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng với sự tƣơng tác của ba yếu tố bổ sung thêm là MnSO4, MgSO4.7H2O và bột đậu tƣơng đã làm tăng 22,7%hiệu suất thu hồi protein tinh thể trong dịch lên men.
Ngày nay, phƣơng pháp tối ƣu môi trƣờng lên men cho vi sinh vật đã và đang đƣợc ứng dụng rất rộng rãi do tính đơn giản, hiệu quả của phƣơng pháp. Năm 2013 tác giả Lee và các cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng để tối ƣu thành phần môi trƣờng lên men vi khuẩn Bacillussp. LX-1 và đã tìm ra điểm tối ƣu giúp nâng hiệu suất thu hồi α-galactosidase 1 lên 6,3 lần so với khi lên men ở điều kiện cơ bản (Lee và cộng sự, 2013). Tác giả Gao và các cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng cũng đã giúp làm tăng hiệu suất thu hồi laccase lên 59,68 lần khi lên men Trichoderma harzianum ZF-2 (Gao và cộng sự, 2013). Tác giả Linna
và các cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt để tối ƣu hóa thành phần mơi trƣờng lên men cho Paecilomyces tenuipes N45đã làm tăng hiệu suất thu hồi sinh khối, adenosine, polysaccharide và axít cordycep lần lƣợt 8,20; 3,58; 23,17 và 31,51% (Linna và cộng sự, 2012).
Nhƣ vậy, môi trƣờng lên men cho vi khuẩn B. thuringiensis từ bã bia có thành phần cụ thể nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia (2,5%TS)+ 0,45 g/l MgSO4.7H2O + 0,05 g/l MnSO4+ 3 g/l bột đậu tƣơng.
3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm
3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng,hình thành bào tử và sinh tinh thể độc của chủng MSS8.4
3.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh trưởng, sinh tổng hợp deltaendotoxin của chủng MSS8.4
Vi khuẩn B. thuringiensis cũng giống nhƣ tất cả các vi sinh vật khác, do có
cấu trúc bé nhỏ và đơn giản nên chịu tác động trực tiếp của các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, pH là một trong những tác nhân ảnh hƣởng trực tiếp tới sinh trƣởng và hình thành các sản phẩm lên men của vi sinh vật. Phần lớn các vi sinh vật phát triển mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên, cũng có một vài nhóm vi sinh vật ƣa axit (vi khuẩn
Lactic) hoặc ƣu kiềm (nấm men candida). Vì vậy, tùy theo nhu cầu sản phẩm lên
men cần có những điều chỉnh hợp lý. Để xác định pH thích hợp cho sinh trƣởng của
Bt, các thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia có pH 2, đƣợc
điều chỉnh về các độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón 500 ml với dung tích mơi trƣờng 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3.13.Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp delta endotoxin của vi khuẩn MSS8.4
Độ pH môi trường Mật độ TCC (CFU/ml) Mật độ SC (CFU/ml) Delta-endotoxin (mg/l) 5,02 3,1 x106 1,0 x106 129±10 6,01 1,1 x108 8,0 x107 489±11 6,52 2,5x108 1,9x108 522±09 7,03 2,6 x108 2,3 x109 521±12 7,51 3,5x108 3,1x108 523±09 8,02 1,1 x108 9,8 x107 331±11 9,01 5,5 x106 2,0 x106 125±12
- Về mặt sinh trƣởng: kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.13 cho thấy MSS8.4sinh trƣởng tốt trên mơi trƣờng trung tính. Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) và pH cao (pH9) khả năng sinh trƣởng của MSS8.4 không tốt, mật độ tế bào chỉ đạt 106 CFU/ml, tƣơng đƣơng với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hơn hàng trăm lần so với mật độ tế bào đạt đƣợc ở các thí nghiệm có pH trung tính. Ở các thí nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt đƣợc trong dịch canh trƣờng sau 48 giờ lên men tƣơng đƣơng nhau, sự khác nhau về số liệu trên Bảng 3.13 ở thí nghiệm có pH 6,52; 7,03 và 7,51 là khơng có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhƣ vậy, vi khuẩn B.
thuringiensissinh trƣởng tốt trong mơi trƣờng có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 (TCC, SC
đều đạt trên 108CFU/ml sau 48 giờ lên men).
- Về khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể: protein tinh thể đƣợc hình thành cùng với quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn MSS8.4, do đó, các thí nghiệm có mật độ bào tử cao cũng là các thí nghiệm có nồng độ delta endotoxin cao. Ở thí nghiệm có pH ban đầu là 6,5 – 7,5 nồng độ delta endotoxin tƣơng đƣơng nhau và đạt trên 520 mg/l sau 48 giờ lên men. Trong khi đó, các thí nghiệm có pH mơi trƣờng ban đầu cao (pH9) và thấp (pH5) nồng độ delta endotoxin chỉ đạt trên 100 mg/l bằng 20% giá trị đạt đƣợc ở các thí nghiệm có pH trung tính.
Quá trình lên men của vi sinh vật sẽ sản sinh ra một số sản phẩm phụ làm thay đổi pH của môi trƣờng, tiến hành kiểm tra pH của dịch canh trƣờng sau 48 giờ lên men cho thấy sau quá trình lên men pH của mơi trƣờng có tăng nhẹ, các thơng số đƣợc thể hiện ở Bảng 3.14.