Muỗi sinh trƣởng chủ yếu trong các đầm lầy, ao hồ hoặc các vũng nƣớc đọng. Muỗi đẻ trứng xuống nƣớc, trứng sẽ nở thành ấu trùng (còn gọi là bọ gậy, cung quăng, lăng quăng). Thức ăn của ấu trùng chủ yếu là các sinh vật nhỏ trong nƣớc, ấu trùng muỗi phải thƣờng xuyên bơi lên mặt nƣớc để lấy oxy trong không khí thơng qua một ống thở. Sau một thời gian, ấu trùng phát triển thành nhộng rồi biến thái thành muỗi trƣởng thành bay lên khỏi mặt nƣớc. Chỉ có muỗi trƣởng thành
mới có khả năng bay và hút máu. Muỗi cái có vịi đặc biệt có thể xun thủng da ngƣời và động vật để hút máu tạo nguồn protein sản sinh ra trứng. Muỗi đực khơng có vịi để hút máu nên chỉ ăn nhựa cây và hoa quả. Cũng chỉ có một nhánh muỗi tên là Toxorhynchites không hút máu.
Tùy vào điều kiện nhiệt độ mơi trƣờng nƣớc, vịng đời một con muỗi từ khi là trứng cho đến muỗi trƣởng thành có thể kéo dài từ khoảng 4 ngày cho đến một tháng. Muỗi sinh trƣởng và phát triển thuận lợi nhất là khoảng 20oC đến 25oC, vì vậy chúng thƣờng xuất hiện ở các nƣớc nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Một số lồi muỗi có khả năng là vật trung gian truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ bệnh sốt rét do muỗiAnopheles gambiae, bệnh sốt xuất huyết do muỗiAedes aegypti,Culex
tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bản… Ở Việt Nam, vào mùa hè và
mùa mƣa sự phát triển của muỗi thƣờng xuyên gây nên các dịch bệnh làm tử vong vài chục bệnh nhân trong số hàng chục nghìn ngƣời nhiễm sốt xuất huyết. Trên thế giới có khoảng hơn nửa tỷ ngƣời mắc bệnh sốt xuất huyết hàng năm, nơi tập trung nhiều nhất là Châu Phi mà muỗi là tác nhân truyền bệnh chính.
1.5. Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis
1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT
Nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng là một bộ phận của ngành bảo vệ thực vật (BVTV). Trên thế giới nhiều cơng trình nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực này đã đạt đƣợc những kết quả khả quan nhƣ chế phẩm sinh học Beauveria & Metarhizium trừ côn trùng, Entomopthoragrylli trừ rầy nâu, châu chấu, sâu róm trên thơng.... Các loại chế phẩm vi khuẩn Pseudomonas cepacia, P. corrugata, P. fluorescents, Bacillus amyloliquefaciens trừ bệnh hại ở thân và rễ cây trồng. Một số loại chế phẩm nấm
đối kháng nhƣ: Gliocladium, Scytalidium, Paecilomyces, Chaetomium... trừ bệnh đạo ôn, đốm lá....
B. thuringiensis ở quy mơ lớn có chi phí tƣơng đối thấp. Do đó, B. thuringiensis đã
đƣợc Edward Steinhaus sử dụng làm thuốc trừ sâu thƣơng mại ở Hoa Kỳ từ năm 1958 bằng việc sử dụng bào tử đƣợc tạo ra do quá trình lên men (Andrews và cộng sự, 1987). Chế phẩm Sporeine đã đƣợc sử dụng từ năm 1938 tại Pháp, nhƣng đến năm 1961 mới đƣợc đăng ký dƣới dạng thuốc trừ sâu. Mặc dù sản phẩm B. thuringiensis có nhiều đặc tính có lợi, nhƣng do hiệu suất kém, chúng khơng cạnh
tranh đƣợc với thuốc trừ sâu hóa. Do đó, việc nâng cao hiệu quả của các sản phẩm
B. thuringiensis và cải tiến nhằm tăng tính độc của B. thuringiensis là mục tiêu
đƣợc đặt ra trong giai đoạn sau (Osman và cộng sự, 2015).
Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của B. thuringiensis đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sự cải
tiến về các chủng sử dụng đã dẫn đến việc tạo ra các chế phẩm mới có hiệu lực gấp 10 lần so với các chủng B. thuringiensis trƣớc đó. Hầu hết các sản phẩm B. thuringiensis đều có nguồn gốc từ kurstaki HD1 (ví dụ Biobit, Dipel và Thuricide),
chế phẩm thƣơng mại đầu tiên là Thurincide, đƣợc sản xuất từ B. thuringiensis
subsp. kurstaki (Beegle và Yamamoto, 1992; Osman và cộng sự, 2015). Mặc dù có nhiều dịng khác đã đƣợc sử dụng để loại trừ các loài sâu bệnh cánh cứng (kurstaki SA-11, kurstaki SA-12), hai cánh (israeliensis) và cánh màng (tenebrionis) (Kaur, 2000).
Thành tựu đáng kể nhất là thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis đã đƣợc nhiều nƣớc nhƣ Mỹ, Anh, Canada, Pháp, Nga, Trung Quốc... sản xuất và sử dụng phổ biến phòng trừ các loại sâu ăn lá, mọt hại cây trồng và trừ muỗi do chất lƣợng thuốc trừ sâu BT rất ổn định, giá thành rẻ và không gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Số lƣợng thuốc trừ sâu BT chiếm từ 3 – 5% trong tổng số thuốc BVTV và chiếm tới 90% thị phần của thuốc trừ sâu sinh học. Đặc biệt tại Mỹ và một số nƣớc đã chuyển gen phòng trừ sâu xanh (Heliothis armigera) từ B. thuringiensis vào cây bơng với diện tích hàng vạn hécta. Ngồi ra một vài gen độc tố từ B. thuringiensis còn đƣợc chuyển gen vào các cây trồng (đậu đỗ, rau thập tự...) để phòng chống các loại sâu hại kháng thuốc hoá học (sâu tơ, sâu khoang, sâu keo da láng, sâu xanh...) (Nguyễn
Văn Tuất., 2004; George và Crickmore, 2012).
Bên cạnh đó, nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học virus côn trùng nhƣ NPV (virus nhân đa diện) để trừ sâu hại thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) cũng đƣợc các nƣớc trên thế giới quan tâm. Nga đã có chế phẩm NPV dạng bột thấm nƣớc với tên VIRIN Ha; VIRIN Dp... trừ sâu xanh hại cây thuốc lá, cà chua, sâu róm thơng…. Tại Trung Quốc đã nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học đa chức năng V-B.
thuringiensis (virus + vi khuẩn) với hiệu quả trừ sâu cao hơn dạng đơn lẻ để trừ sâu
hại trên hàng vạn hécta bông, thuốc lá, cà chua, đậu đỗ. Để sản xuất chế phẩm NPV trừ sâu hại cây trồng, các nƣớc Nga, Mỹ, Đức… đã dùng công nghệ tế bào để nhân nuôi virus côn trùng ở dạng invivo cũng nhƣ invitro nhằm thoả mãn nhu cầu sử
dụng chế phẩm trong sản xuất nông - lâm nghiệp (Nguyễn Văn Tuất, 2004).
Ngày nay, thị trƣờng thuốc trừ sâu BT bị chi phối bởi Abbott Laboratories (Chicago, IL) và Novartis (đƣợc thành lập năm 1996 bởi Ciba và Sandoz), chiếm 70% lƣợng chế phẩm sản xuất tồn cầu. 30% chế phẩm cịn lại thuộc về khoảng 30 công ty với hơn 100 công thức sản phẩm BT khác nhau. Hầu hết các chế phẩm chứa một độc tố B. thuringiensis đơn lẻ, một số kết hợp tới 5 độc tố (Osman và
cộng sự, 2015).
Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu BT đƣợc ứng dụng đầu tiên tại Viện Bảo vệ thực vật năm 1971. Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất BT bằng phƣơng pháp thủ công và bán công nghiệp trong phịng thí nghiệm. Năm 1973-1976, BT đƣợc sản xuất chủ yếu trên môi trƣờng đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác nhƣ: khô lạc, bột đậu tƣơng, bột cá,.... Các chủng giống sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này chủ yếu có nguồn gốc từ Trung Quốc. Các chế phẩm này đã đƣợc sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và thu đƣợc kết quả tốt. Năm 1975, chế phẩm BT đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp lên men chìm trong nồi lên men tự tạo tại phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc phân viện Khoa học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh. Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm BT theo phƣơng pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men
lên đến 5 m3. Từ năm 1984 - 1993, việc sản xuất chế phẩm BT đã giảm sút vì các chế phẩm BT sản xuất ra có chất lƣợng không cao, tốc độ tiêu thụ giảm. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng BT đƣợc mở rộng hơn. Hiện nay, có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu và sản xuất chế phẩm BT nhƣ viện Công nghệ sinh học, viện Bảo vệ thực vật, viện Công nghệ sau thu hoạch, Viện Công nghiệp thực phẩm (Ngơ Đình Bính và cộng sự, 2012)
1.5.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis
Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT đƣợc thực hiện trên cơ sở phƣơng pháp lên men chìm (submerge fermentation) và lên men bề mặt: bao gồm lên men trên môi trƣờng xốp (soft medium) hoặc bán rắn (semisolid medium). Trong quá trình lên men ngƣời ta cung cấp các chất dinh dƣỡng thích hợp cho vi sinh vật sinh trƣởng, phát triển để nhận đƣợc sản phẩm của quá trình trao đổi chất.
1.5.2.1. Phương pháp lên men bề mặt
Dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có hoặc khơng có khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các hạt cơ chất này có thể đóng vai trị làm nguồn chất dinh dƣỡng, ví dụ nhƣ cám lúa mì, bột ngô, bánh hạt bông loại dầu… hoặc chỉ đơn giản đóng vai trị nhƣ chất mang vơ cơ. Ở phƣơng pháp này, vi khuẩn sẽ mọc trên bề mặt cơ chất và tiếp nhận ơxy của khơng khí để sinh trƣởng.
Chuẩn bị môi trƣờng lên men: để chuẩn bị mơi trƣờng ni cấy vi khuẩn có độ thơng thống tốt, các loại ngun liệu khơng nên xay nghiền quá nhỏ mà nên xay vỡ thành các mảnh 1 – 3 mm, trộn thêm cám trấu hay mùn cƣa, bã mía… rồi trãi mỏng ra các khay.
Thực hiện: làm ẩm môi trƣờng bằng nƣớc có pH 6,5 – 7,5, hấp vô trùng ở121oC khoảng 1h. Để nguội vệ nhiệt độ phòng, phun dịch giống đã chuẩn bị sẵn, đảo đều. Các khay lên men đƣợc đặt trong phịng ni có quạt hút, điều chỉnh nhiệt độ trong phòng lên men 28 – 35oC. Định kỳ đảo trộn khối môi trƣờng để vi khuẩn phát triển đều khắp.
Sau khi kết thúc nuôi cấy, thu gom sản phẩm ở các khay và sấy ở khơng khí nóng 40 – 450C để đạt độ ẩm dƣới 10%.
1.5.2.2.Lên men chìm
Đây là cơng nghệ lên men hiện đại, đạt hiệu quả cao. Trong đó, vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong các nồi lên men có thể tích lên đến vài chục mét khối. Đƣợc thổi khí qua máy nén trong điều kiện vơ trùng. Thiết bị đƣợc trang bị hệ điều khiển tự động cung cấp khí, nhiệt độ, điều chỉnh pH. Thời gian nuôi cấy khoảng 2 – 3 ngày. Mật độ tế bào trong dịch lên men có thể lên đến hàng tỷ trong 1 ml dịch nuôi cấy. Cơng nghệ lên men chìm bao gồm các cơng đoạn chính nhƣ sau:
Chuẩn bị giống vi sinh vật: giống phải đảm bảo là giống chuẩn có hoạt lực diệt sâu cao, khơng bị tạp nhiễm. Trƣớc khi đƣa vào sản xuất giống đƣợc hoạt hóa đảm bảo các tế bào đang ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh.
Chuẩn bị môi trƣờng lên men: môi trƣờng dinh dƣỡng phải đảm bảo cung cấp đầy đủ dƣỡng chất, đƣợc vô trùng và điều chỉnh pH về giá trị thích hợp (với hầu hết các chủng B. thuringiensis có pH thích hợp từ 6,5-7,5).
Lên men thu hồi sản phẩm: các thơng số lên men nhƣ tốc đột hổi khí, tốc độ khuấy đƣợc cài đặt theo đặc tính của từng chủng vi sinh vật. Thời điểm kết thúc quá trình lên men đƣợc xác định là thời điểm 95% tế bào đã chuyển hóa thành bào tử và tinh thể độc.
Thu hồi sản phẩm (downstream processing): dịch ni cấy có thể đóng chai dùng trực tiếp ở dạng lỏng hay qua ly tâm thu sinh khối rồi thêm phụ gia, sấy…hoàn thành dạng bột.
Quy trình sản xuất chế phẩm BT bằng phƣơng pháp lên men chìm theo sơ đồ sau :
Hình 1.10. Quy trình sản xuất chế phẩm BTbằng phƣơng pháp lên men chìm
1.5.3. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trường và con người 1.5.3.1. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người
Tính đặc hiệu của độc tố sinh ra bởi vi khuẩn B. thuringiensis đối với cơn
trùng đích là một trong những tính trạng khiến chế phẩm BT trở thành thuốc trừ sâu sinh học lý tƣởng. Trên thực tế, các chủng B. thuringiensis khác nhau sản sinh ra
các protein độc đối với một số lồi cơn trùng nhất định. Độc tố của protein B. thuringiensis tƣơng tác trực tiếp với thụ thể. Chỉ những cơn trùng trong ruột có các
vị trí thụ thể đặc trƣng để protein độc tố có thể kết bám mới bị ảnh hƣởng bởi protein B. thuringiensis. Ngƣời và đại đa số các cơn trùng có ích khơng có các thụ
thể này.
Cục Bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ (US Environmental Protection Agency US- EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein B. thuringiensis đã đƣợc thử ở liều lƣợng cao. Theo Extension Toxicology Network 1999, “kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 ngƣời mỗi ngày ăn 1 gram B. thuringiensis thƣơng mại
trong vòng 5 ngày và trong các ngày khác nhau không gây ra chứng bệnh gì. Những ngƣời ăn 1 gram B. thuringiensis/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn tồn khơng bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”. Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trong điều kiện phịng thí nghiệm) (Extoxnet,1999).
1.5.3.2. Ảnh hưởng đến môi trường
Protein B. thuringiensis tồn tại không bền trong đất và đƣợc phân loại vào dạng bất động vì nó khơng có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nƣớc ngầm. Protein này không bền vững trong điều kiện đất axít và bị phân hủy nhanh chóng khi phơi dƣới ánh sáng mặt trời, dƣới tác động của tiaUV. Do vậy, sử dụng thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis để bảo vệ cây trồng hồn tồn khơng tác động xấu tới môi trƣờng.
Ngày nay, các nhà khoa học không những sử dụng B. thuringiensis để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học mà còn chuyển gen B. thuringiensis vào cây trồng. Kết quả cho thấy, các cây chuyển gen có khả năng kháng sâu rất tốt. Để đánh giá tác động của cây chuyển gen B. thuringiensis, các chuyên gia đã tiến hành những
nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hƣởng của cây trồng B. thuringiensis đối với sinh vật đất và các lồi cơn trùng khác đƣợc xem là có ích trong nơng nghiệp. Kết quả cho thấy, cây chuyển gen B. thuringiensis không gây ra ảnh hƣởng bất lợi đối với các sinh vật đất, thậm chí ngay cả khi các sinh vật này đƣợc xử lý B. thuringiensis với liều lƣợng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều
kiện trồng trọt tự nhiên. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng cho thấy khơng có sự thay đổi nào trong quần thể visinh vật đất giữa các cánh đồng có nguyên liệu thực vật B. thuringiensis và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống (Donegan và
cộng sự, 1995)
1.5.4. Tồn dư của thuốc trừ sâu BT 1.5.4.1. Tồn dư trong nước
Có 2 phƣơng thức chính về sự tồn tại của thuốc trừ sâu sinh học trong tự nhiên: có sẵn trong môi trƣờng hoặc thông qua các hoạt động của con ngƣời, đặc biệt là hoạt động nông nghiệp, gồm các chủng vi sinh vật nhƣ B. thuringiensis, Coniothyrium minitans, Sclerotinia minor, và Chondrosterum purpureum (Szewczyk và cộng sự,2006; Chandler và cộng sự, 2011; Glare và cộng sự, 2012; Ntalli và Caboni, 2012).Tuy nhiên, với sự gia tăng sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu sinh học, các hoạt động của con ngƣời đang là nguyên nhân chính của tồn dƣ thuốc trừ sâu sinh học trong môi trƣờng nƣớc (Chandler và cộng sự, 2011). Sau khi đƣợc sử dụng để kiểm soát dịch hại, thuốc trừ sâu sinh học đƣợc chuyển hóa một phần nhờ vi sinh vật, phần lớn sẽ bị rửa trôi và vận chuyển đến các con sông, hồ, đập. Đây là nguyên nhân chính dẫn đến tồn dƣ của thuốc trừ sâu sinh học vào môi trƣờng nƣớc (Jorgensen và cộng sự, 2012; Rodrigues và cộng sự, 2013). Ô nhiễm nguồn nƣớc bởi thuốc trừ sâu sinh học có thể gây ra nhiều vấn đề đến sức khỏe con ngƣời, cũng nhƣ ảnh hƣởng đến các loài thủy sản (Plimmer, 1999; Raizada và cộng sự, 2001; Winkaler và cộng sự, 2007; Chandler và cộng sự, 2011). Một số nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để xác định sự vận chuyển của thuốc trừ sâu từ cây trồng vào suối (Douville và cộng sự, 2005; 2007; 2009; Deb và cộng sự, 2009).
Nồng độ của thuốc trừ sâu sinh học tìm thấy ở sơng, hồ phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tổng lƣợng đƣợc sử dụng, cũng nhƣ chu kỳ bán rã của thuốc trừ sâu sinh học, thời gian phân hủy. Thuốc trừ sâu sinh học có thể bị phân hủy bởi ánh sáng, phân hủy sinh học, hấp phụ và thủy phân (Cleveland và cộng sự, 2002; Thompson và cộng sự, 2004; Sanderson và cộng sự, 2007; Prihoda and Coats, 2008; Schleier và cộng sự, 2008; Totowa và cộng sự, 2009). B. thuringiensis đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một thuốc bảo vệ thực vật trong quản lý dịch hại tổng hợp. Douville và cộng
sự (2005) cho thấy, nội độc tố Cry1Ab của B. thuringiensis có chu kỳ bán rã 4 và 9 ngày tƣơng ứng trong nƣớc và đất.
1.5.4.2. Tồn dư trong đất
Khi thuốc trừ sâu sinh học đƣợc thải ra ngồi mơi trƣờng, nhiều quá trình nhƣ hấp phụ, bay hơi, chảy bề mặt, rửa trơi và phân hủy có thể xảy ra. Việc nghiên cứu tồn dƣ của thuốc trừ sâu sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp là cần thiết để đảm bảo an tồn thực phẩm và bảo vệ mơi trƣờng (Liang và cộng sự, 2011). Đất là bộ lọc tích cực, nơi mà các hợp chất hóa học có thể bị phân hủy bởi các q trình