Kết quả thử nghiệm cho thấy, hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của chế phẩm sinh học BT tƣơng đối cao đạt 53,33 – 84,67% sau 5 ngày thử nghiệm. Kết quả đạt cao nhất (84,67%) khi bổ sung lƣợng chế phẩm là 2 g vào 500 g bã bia. Vì vậy, cơng thức 3 có thể ứng dụng để thử nghiệm ngồi hiện trƣờng.
3.4.2.3. Chế tạo công thức cho chế phẩm diệt dịi ruồi nhà ngồi thực địa
Từ kết quả nghiên cứu của phần 3.4.3.1 (thử nghiệm chế phẩm Btdiệt dịi
ruồi nhà qui mơ pilot) thu đƣợc cơng thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2 hoặc 3 cho hoạt tính cao nhất. Tiến hành thử nghiệm cơng thức 3 ngồi thực địa với 3 loại giá thể khác nhau phù hợp với điều kiện thực tế:
Công thức 3.1: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức 3.2: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g phân ủ + 50 ấu trùng dịi tuổi 2.
Cơng thức 3.3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g rác thải hữu cơ + 50 ấu trùng dịi tuổi 2.
Cơng thức đối chứng: 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dịi tuổi 2.
Các cơng thức đƣợc trộn đều, chứa trong các xô nhỏ, đặt ngồi trời, có phủ vải màn để tránh ruồi ngoài tự nhiên đẻ trứng vào. Kết quả thể hiện trong Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Các công thức chế phẩm BT diệt ruồi cho thử nghiệm ngồi thực địa
TT ST T Cơng thức thử nghiệm Số ấu trùng Musca domestica ban đầu
Tỷ lệ ấu trùng chết(%) Sau 3 ngày Sau 5 ngày
1 Công thức 3.1 150 62,33 83,67 2 Công thức 3.2 150 62,67 83,33 3 Công thức 3.3 150 63,33 84,33
4 Công thức ĐC 150 0,67 0,67
Kết quả cho thấy, công thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g giá thể + 50 ấu trùng dòi cho tỷ lệ chết tƣơng đƣơng nhau khi thử trên các giá thể khác nhau (phân ủ, rác thải hữu cơ, phế thải nông nghiệp), điều này phù hợp với điều kiện tự nhiên (ấu trùng ruồi có trên nhiều giá thể khác nhau). Vì vậy, cơng thức 3 thích hợp để ứng dụng ngồi hiện trƣờng.
3.4.2.4. Mơ hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dịi ruồi nhà ngồi thực địa
Qua khảo sát sự xuất hiện và phát triển các ổ bọ dòi tại các xã thuộc Phủ Lý– Nam Hà. Chúng tơi tiến hành bố trí mơ hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi tại 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam theo mơ hình nhƣ sau:
- Xã Đinh Xá thử nghiệm tại khu vực nƣớc thải của chuồng ni lợn, bố trí thí nghiệm 1 (TN1) và đối chứng 1 (ĐC1).
- Xã Phù Vân có 2 khu vực thử nghiệm là bể phân ủ của 2 hộ dân: TN2, TN3, ĐC 2, ĐC 3).
Do thực tế ngoài hiện trƣờng số dịi rất nhiều (trung bình 864 con/lít), vì vậy mỗi khu vực thử nghiệm đƣợc bổ sung chế phẩm nhiều hơn so với công thức thử
nghiệm trong phịng thí nghiệm, cụ thể: TN1 là 150 g chế phẩm/m2diện tích bề mặt, TN2 và TN3 là 500 g.
Theo dõi hiệu quả của chế phẩm sau 30 ngày. Đối chứng để tự nhiên không dùng chế phẩm. Sau khi bố trí thí nghiệm và thử nghiệm ngồi hiện trƣờng thuộc 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam thu đƣợc một số hình ảnh và kết quả trình bày trong Bảng 3.19 và Hình 3.32).
Kết quả thử nghiệm đƣợc ghi lại sau mỗi 24 h xử lý cho thấy, tỷ lệ ấu trùng dòi chết tăng theo từng ngày và sau 3 ngày thử nghiệm hiệu quảc ủa chế phẩm đạt 53,3-85,2%, sau 7 ngày tỷ lệ chết đạt 83,7-89%.
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: sau 30 ngày thử nghiệm tỷ lệ chết đạt 93,1–96,5%. Sở dĩ hiệu quả của chế phẩm vẫn còn cao sau khoảng thời gian dài là do khu vực thử nghiệm nằm riêng biệt, chế phẩm không bị phân tán ra ngoài và do chế phẩm thuộc dạng sinh khối cho nên vikhuẩn B. thuringiensis vẫn tiếp tục phát triển khi gặp môitrƣờng thuận lợi.
Bảng 3.19. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm BT dạng bột thấm ƣớt.
Thí nghiệm Mật độ dịi ban đầu (con/lít)
1 ngày 3 ngày 7 ngày 30 ngày
Mật độ dịi (con/lít) Tỷ lệ chết (%) Mật độ dịi (con/lít) Tỷ lệ chết (%) Mật độ dịi (con/lít) Tỷ lệ chết (%) Mật độ dịi (con/lít) Tỷ lệ chết (%) TN1 663,3 579 12,7 98 85,2 73 89 23 96,5 TN2 1297,3 1143 11.89 428,3 66,98 206.3 84,09 76.3 94,1 TN3 1426,67 1283,3 10 666.3 53,3 232 83,7 98 93,1 ĐC1 216 216 0 208.3 3,56 197.7 8,47 203.3 5,87 ĐC2 412,3 412,3 0 406.3 1,45 400 2,98 420.3 - ĐC3 523,7 523,7 0 511 2,4 498.3 4,85 517.7 1,14
Ở các ô đối chứng, mật độ dịi sau 3 ngày, 7 ngày giảm khơng đáng kể, thậm chí sau 30 ngày còn tăng nhẹ so với sau 7 ngày vì trong các ơ đối chứng cịn có trứng dịi, sau 30 ngày lại có lứa dịi mới phát triển trong khi số con chết thì rất ít.
Nhƣ vậy, đã bố trí thành cơng mơ hình thử nghiệm chế phẩm diệt dịi ngồi hiện trƣờng, tỷ lệ ấu trùng dịi chết đạt hiệu quả cao từ 83,7-89% tại 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm sau 30 ngày là 93,1– 96,5%.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Trong số 440 chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt nam, đã sàng lọc và
tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4, chủng này
có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà Musca dometisca và ấu trùng muỗi cao. Tỷ lệ
chết sau 5 ngày đạt 100% với nồng độ 109 CFU/ml.
2. Gen cry2A từ chủng Btk MSS 8.4 đã đƣợc tách dịng, xác định trình tự nucleotide và đăng ký trên GenBank với mã số KM588296.1
3. Khả năng diệt ấu trùng của chủng MSS8.4 có liên quan đến gen cry2A. Gen cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Xác định
đƣợc các thơng số tối ƣu cho q trình cảm ứng là: nồng độ IPTG 1mM, nhiệt độ 370C và thời gian là 4 giờ. Tinh sạch đƣợc protein Cry2A tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin.
4. Bã malt bia đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp axit nhiệt cho hàm lƣợng các bon, nitơ cao làm nguyên liệu nuôi cấy chủng vi khuẩn Btk MSS8.4 với mật độ tế bào đếm đƣợc đạt 4,9 x 108
CFU/ml.
5.Mơi trƣờng bã malt bia thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn MSS8.4 sinh tạo độc tố là : dịch thủy phân bã bia (2,5%TS)+ 0,45 g/l MgSO4.7H2O + 0,05 g/l MnSO4+ 3 g/l bột đậu tƣơng. Ở môi trƣờng này tổng tế bào, bào tử, nồng độ deltaendotoxin lần lƣợt đạt 4,5x108 CFU/ml, 4,3x108 CFU/ml và 529,11 mg/l.
6. pH ban đầu từ 6,5-7,5, nhiệt độ 300
C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lên men 72 h là điều kiện thích hợp nhất để lên men sản xuất chế phẩm BT. Chế phẩm thu đƣợc có hiệu quả xử lý diệt ấu trùng ruồi nhà ngoài thực địa khá cao, từ 93,1 đến 96,5%.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu về khả năng diệt ấu trùng rồi nhà của protein tái tổ hợp pCry2A.
2. Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học
BT trên môi trƣờng Dịch thủy phân bã bia ở quy mô lớn hơn.
3. Nghiên cứu sâu hơn về tính ổn định, các yếu tố khách quan ảnh hƣởng đến chất lƣợng của chế phẩm cũng nhƣ sự tồn dƣ của chế phẩm BT ngoài môi trƣờng sinh thái.
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Phạm Thùy Dƣơng, Ngơ Đình Bính, Lê Đức Khánh, Nguyễn Thị Hịa, Chu Kỳ Sơn (2017), “Tối ƣu thành phần môi trƣờng lên men từ dịch thủy phân bã thải nhà máy bia làm môi trƣờng lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh protein diệt
ruồi nhà„. Tạp chí Bảo vệ thực vật,4 (273): tr.35-41
2.Phạm Thùy Dƣơng, Ngơ Đình Bính, Lê Đức Khánh, Nguyễn Thị Hòa (2017),
“Xử lý bã thải của ngành công nghiệp sản xuất bia thành môi trƣờng nuôi cấy vi
khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 sinh độc tố diệt ruồi nhà„.
Tạp chí An tồn-sức khỏe và mơi trường lao động, 1, 2& 3: tr. 34-40
3.Phạm Thùy Dƣơng, Ngơ Đình Bính, Trịnh Thị Thu Hà,Lê Đức Khánh (2017),
“Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của
chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4„. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học,15(3): tr. 563-569.
4.Ngơ Đình Bính, Đặng Văn Tiến, Phạm Thùy Dương, Trịnh Thị Thu Hà, Lê Thị Minh Thành(2018), “Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki MSS 8.4
và chế phẩm diệt ruồi nhà Musca Domestica chứa dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003). Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. xb khoa học và thuật à i: 112-134.
2. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002). Thu nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis. Kỷ yếu
2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, 296 – 302.
3. Ngơ Đình Bính (2005). Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học. Viện Đại học Mở
Hà N i.
4. Ngơ Đình Bính (2011). Đánh giá và khai thác nguồn gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam để phục vụ sản suất thuốc trừ sâu sinh học, Báo
cáo tổng hợp Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thƣ với Hoa Kỳ, Viện Công nghệ Sinh học.
5. Ngơ Đình Bính (2000). Nghiên cứu sản xuất và sử dụng hỗn hợp chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật trừ sâu bệnh hại cây trồng nơng lâm nghiệp, Báo cáo kết quả Hồn thiện công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm Bt và hỗn hợp với các chế phẩm khác trong đề tài KHCN 02 – 07B.
6. Ngơ Đình Bính,(2003). Báo cáo kết quả Nghiên cứu sử dụng bộ giống gốc
Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao trừ sâu hại cây trồng và phát triển mơ
hình ứng dụng phịng trừ tổng hợp cho vùng rau Vân Tảo, Thƣờng Tín, Hà Tây, Đề tài KC 04 – 12.
7. Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hƣơng, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung và Đặng Văn Tiến,(2012). 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringiensis tại Việt Nam, i nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện hoa học và Công nghệ Việt am, pp. 286-297.
8. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Đình Tuấn, Trịnh Thị Thu Hà, (2009). Hiệu quả diệt ấu trùng muỗi của chế phẩm Bacillus thuringensis subsp. israelensis sản xuất tại Việt Nam.Tạp chí hoa học và Cơng nghệ. 47, 5, 45 – 53.
9. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt. (2002). Thu nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis. Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học. 2000-2001. 296-303.
10. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính,(2004). Nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ
bản trong Khoa học sự sống định hƣớng Nông lâm nghiệp miền núi, Thái Nguyên 2004. NXB KHKT. 59-62
11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003). Vi sinh vật học. NXB giáo dục.
12. Trịnh Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Luy, Phạm Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Hiền, Ngơ Đình Bính, (2013). Sự phân bố gen cry, cyt và hoạt tính diệt ấu trùng
muỗi của một số chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ rừng ngập mặn
Thái Bình. Kỷ yếu H i nghị Công nghệ sinh học 2013, 71-75.
13. Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999). Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào cây hai lá mầm. Báo cáo
H i nghị sinh học toàn quốc, 1371-1376.
14. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. Di truyền học, tập 1. NXB Đại học Sư Phạm, 49 – 53.
15. Khuất Hữu Thanh (2003). Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen.NXBKHKT, 137 – 140, 206 – 210.
16. Lƣơng Đức Phẩm (2008) Công nghệ xử lý nƣớc thải bằng biện pháp sinh học, XB Giáo dục, pp. 87-90.
17. Nguyễn Hoài Trâm (2004) Sản xuất chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao diệt sâu hại cây trồng nông nghiệp, Báo cáo kết
quả thực hiện đề tài nhánh thuộc đề tài KHCN cấp nhà nƣớc. Mã số KC04 - 12
18. Nguyễn Hoài Trâm, Phạm Thu Trang, Nguyễn Hồng Nhung, Đỗ Thị Thanh Huyền, Nguyễn Ngân Minh, Vũ Thị Thảo, Chu Thắng, Mai Thu Hiền, Ngơ Đình Bính và Nguyễn Văn Thƣởng (2001).Nghiên cứu sinh tổng hợp protein và tạo chế phẩm diệt ấu trùng muỗi từ các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis và Bacillus Sphaericus, i thảo sinh học quốc tế Sinh học. 2,
pp. 470-475.
19. Nguyễn Thị Vân Trang, Đặng Thị Mai Anh, Phạm Tuấn Linh, Tăng Thị Chính và Nguyễn Hồng Khánh (2012) Nghiên cứu tiềm năng tái sử dụng bùn thải thành nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật hữu ích,Tạp chí khoa học và
Công nghệ 50(2B), pp. 236-244.
20. Nguyễn Văn Tuất (2004) Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh học. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài KHCN cấp nhà nƣớc,Báo cáo kết quả thực hiện đề
tài C cấp nhà nước. Mã số KC04 - 12
Tiếng Anh
21. Reyaz A.L., Indra Arulselvi (2016) Cloning, Characterization and Expression of a Novel Haplotype cry2A-type Gene from Bacillus thuringiensis strain SWK1, native to Himalayan valley Kashmir,Journal of Invertebrate Pathology 136
22. Abbott, W.S., (1925). A method of computing the effectiveness of an insecticide. Jhp[;n1, Azizbekyan RR, Bernier RL, de Barjac H, Saindoux S, Valéro JR, Yu MX., 1995. Phage typing of Bacillus subtilis and B. thuringiensis. Res Microbiol. 1995 Oct;146(8):643-57.
23. Barjac D H & Frachon E. (1990). Classification of Bacillus thuringiensis
strains.Entomophaga 35, 233-240.
24. Barjac D H. (1981). Indentification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis. 36-42 Burges H.D. (edited). In microbial control of pests anđ plant Diseasis 1970- 1980.
25. Bietlot, H. P., J. P. Schernthaner, R. E. Milne, F. R. Clairmont, R. S. Bhella, and H. Kaplan. (1993). Evidence that the CryIA crystal protein from Bacillus
thuringiensis is associated with DNA. J. Biol. Chem. 268:8240-8245.
26. Binh N.D., Canh N.X., Nguyet N.T.A., Tuan N.D, Thuy P.K., Hanh M.T., Shin I.A. and Ohba M. (2007) Characterization of Bacillus thuringiensis
strains in the Vietnam Bacillus thuringiensis Collection,Science Publishing and Creative Service Agriculture and Agri-Food Canada, pp. 126-130.
27. Binh Ngo Dinh, Thanh Le Thi Minh, Hoa Nguyen Thi, Chinh Tang Thi, Shin-Ichiro Asanoand Hisanori Bando (2013). Screening, expression and characterization of scarabcidal protein a strain (MHB11.3) of Bacillus thuringiensis serovar galleriae in Vietnam. African Journal of Microbiology Research, 7(24): 3018-3025.
28. Boesten, J.J.T.I., Van der Linden, A.M.A. (1991). Modelling the influence of sorption and transformation on pesticide leaching and persistence. Journal of
Environmental Quality 20: 425–435.
29. Bottone EJ (2010).Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin Microbiol Rev 23:382–438
30. Box G. and Wilson K.B. (1951) On the experimental attainment of optimum conditions, J. Roy. Stat. Soc., pp. 13-145.
31. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding,Analytical Biochem. 72, pp. 248-254.
32. Braun S. (2000) Bioassays of Bacillus thuringiensis 1D. Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental uses, In: Navon, A.,
Ascher, K.R.S (Eds.), Bioassays of Entomopathogenic Microbes and Nematodes. CAB International, pp. 49-72.
33. Bravo, A. (1997). Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis δ-
endotoxin family proteins anh their functional domains. J Bacteriol., 179,
2793-2801.
34. Bravo, A. (1997). Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis delta- endotoxin family proteins and their functional domains. Journal of
bacteriology, 179(9), 2793.
35. Bravo, A., Gómez, I., Porta, H., García Gómez, B. I., Rodriguez Almazan, C., Pardo, L., & Soberón, M. (2013). Evolution of Bacillus thuringiensi Cry toxins insecticidal activity. Microbial biotechnology, 6(1), 17-26.
36. Burges H. D. (2001). Bacillus thuringiensis in Pest Control.Pesticide Outlook. P. 90- 98.
37. Carlson C.R. , Caugant D.A. and Kolsto A.B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains, Appl. Environ. Microbiol. 60, pp. 1719-1725.
38. Carlson, C. R., and A.-B. Kolstø. (1993). A complete physical map of a
Bacillus thuringiensis chromosome. J. Bacteriol. 175:1053-1060.
39. Chandler, D, A S Bailey, G M Tatchell, G Davidson, J Greaves, and W P Grant. (2011). The development, regulation and use of biopesticides for integrated pest management. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 366 (1573) (July 12): 1987–98. 40. Chicott, C. N., Wigley, P. J. 1993. Insecticidal activity of Bacillus
thuringiensis crytal protein. Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting. P. 43-52.