CHƢƠNG III KẾTQUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các
3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể
Các chủng B. thuringiensis có khả năng sinh ra các dạng tinh thể: hình cầu, hình lƣỡng tháp, hình lập phƣơng, hình khơng xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Hình 3.4. Hình ảnh tinh thể của các chủng Bt phân lập tại Việt Nam chụp bằng kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10000 lần.
A: Hình lƣỡng tháp; B: Hình lƣỡng tháp và hình lập phƣơng; C: Hình cầu; D: Hình lập phƣơng và hình cầu; E: Hình lƣỡng tháp, lập phƣơng và hình cầu; F: Hình lƣỡng tháp, lập phƣơng và hình khơng xác định
440 chủng B. thuringiensisđã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam
đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng MPA. Sau 3 ngày quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn.
A B C
Hình 3.5.Kết quả phân loại hình thái tinh thể của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam.
Kết quả Hình 3.4 và 3.5 cho thấy, tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh thể ở tất cả các hình dạng. Có những chủng có khả năng sinh từ 1 – 3 loại tinh thể. Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lƣỡng tháp (42,2%); 193/440 chủng sinh tinh thể hình cầu (43,8%); 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập phƣơng (10,5%); 15/440 chủng sinh tinh thể hình khơng xác định (3,5%).
Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại tỉnh Thành Đơ – Trung Quốc có dạng hình tháp lƣỡng cực và hình cầu, chiếm tới 91,8% (Yu và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các chủng
B. thuringiensis thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phƣơng
(26,9%) và hình tháp lƣỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan, 2010). Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là dạng không định hình (27%) và tháp lƣỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự, 2014). Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập đƣợc trong nghiên cứu này cũng nhƣ trong các nghiên cứu khác có thể do sự khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng B. thuringiensis cũng nhƣ đặc điểm protein Cry của các chủng thu thập đƣợc.
Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang gen cry2A rất đa dạng chúng có thể sinh ra từ các dƣới loài Bt. serovar kurstaki,Bt. serovar sotto, Bt.serovar israelensis, Bt. serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình cầu
và hình lƣỡng tháp. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch.
3.1.3. Phân loại các chủng B. thuringiensis phân lập
Vi khuẩn B. thuringiensis đƣợc chia ra làm rất nhiều dƣới loài khác nhau,
mỗi dƣới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Cho đến nay, có ít nhất 82 dƣới lồi B.
thuringiensis đã đƣợc phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch với kháng nguyên H
(Horani và cộng sự, 2003; Joung và Côte’; 2001; Lecadet và cộng sự, 1999; Roh và cộng sự, 2009). Theo các tài liệu đã đƣợc công bố trên thế giới,các dƣới loài Bt. kurstaki, Bt. tolwwarthi , Bt. sotto, Bt. israelensis, Bt. kenyae... có khả năng diệt
cơn trùng bộ hai cánh. Từ các chủng vi khuẩn B. thuringiensis phân lập đƣợc có khả năng sinh tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp, lựa chọn đƣợc 45 chủng để phân loại bằng kít huyết thanh miễn dịch.
Với kít huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật cho 60 dƣới lồi B. thuringiensis khác. Thơng qua phản ứng ngƣng kết với các typ
huyết thanh, xác định đƣợc 32 chủng B. thuringiensis (chiếm 71%), trong đó có 5
chủng thuộc dƣới loài Bt. serovar. kurstaki, 2 chủng Bt. serovar israelensis (Bảng 3.1). Các chủng cịn lại khơng ngƣng kết với các huyết thanh hiện có trong bộ sƣu tập của phịng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học. Nguyên nhân có thể chúng thuộc các dƣới lồi cịn lại hoặc là dƣới loài mới.
Hình 3.6. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học.
A: Trƣớc khi nhỏ huyết thanh miễn dịch
B: Sau khi nhỏ huyết thanh miễn dịch typ 3a,3b
Bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch, xác định đƣợc 7 chủng thuộc 2 dƣới loài Bt. serovar. kurstaki, Bt. serovar israelensis. Các chủng này sẽ đƣợc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) và sàng lọc gen
cry2A.
Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh
STT Dƣới loài Bacillus thuringiensis Typ huyết thanh Số chủng ngƣng kết Tỷ lệ (%)
1 Bacillus thuringiensisserovar israelensis 14 2 6,25 2 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki 3a,3b 5 15,62 3 Bacillus thuringiensisserovar
sumiyoshiensis
3d 9 28,13
4 Bacillus thuringiensisserovar coreanensis 25 4 12,5 5 Bacillus thuringiensisserovar neoleonensis 24a, 24b 2 6,25 6 Bacillus thuringiensisserovar aizawai 7 5 15,63 7 Bacillus thuringiensisserovar yunnanensis 20a, 20b 1 3,13 8 Bacillus thuringiensisserovar pakistani 13 3 9,38 9 Bacillus thuringiensisserovar oswaldocruzi 38 1 1,39
Tổng số chủng phản ứng dƣơng: 32 chủng chiếm 71,11% Số chủng phản ứng âm: 13 chủng chiếm 28,89%
Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện ở tất cả các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki. Ngoài ra, chủng B. thuringiensis serovar israelensis cũng đƣợc tìm thấy phổ biến ở các môi trƣờng sống của muỗi
(Martinez và Caballero, 2002). Do đó, các chủng thuộc nhóm này sẽ đƣợc đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng B.
thuringiensis thuộc dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar israelensis ta pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả. Phƣơng pháp thử hoạt tính diệt ấu trùng đã mơ tả trong phần 2.3.3.
Tỷ lệ ấu trùng chết đƣợc tính sau 3 và 5 ngày thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng
B. thuringiensis sau 3 và 5 ngày thử nghiệm
Tên chủng
Bacillus thuringiensis
Thử nghiệm với ấu trùng muỗi
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà
Thử nghiệm với ấu trùng ruồi đục quả Tỉ lệ chết sau 3 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 3 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 5 ngày (%) Tỉ lệ chết sau 7 ngày (%) LD 2.21 66,67 90,33 83,33 100 LNT 7.12 66,67 96,67 83,33 100 16,67 33,33 LNT 16.6 73,33 83,33 86,67 100 13,33 16,67 MSS 1.1 50 100 66,67 83,33 3,33 10 MSS 4.2 46,67 78,67 60 76,67 0 10 MSS 6.3 63,33 98,33 80 100 13,33 20 MSS 8.4 80 100 93,33 100 20 33,33
4D4 6,67 30 16,67 30 0 0 Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B. thuringiensis đƣợc tuyển chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao. Tỷ lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời gian thí nghiệm. Ở nồng độ 109 bào tử/ml các chủng đƣợc lựa chọn có tỷ lệ ấu trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày. Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi đục quả là tƣơng đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm.
Trong số các chủng phân lập đƣợc, chủng LNT 7.12 và MSS 8.4 cho khả năng diệt ấu trùng cao. Do vậy, 2 chủng này đƣợc nghiên cứu sâu hơn về gen cry2A để có thể xác định sự có mặt của gen cry2A có liên quan đến khả năng diệt ấu trùng hay không và nghiên cứu tạo chế phẩm diệt bộ hai cánh.
3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt cơn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập
3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR huyết thanh bằng phương pháp PCR
Để khẳng định khả năng diệt ấu trùng bộ hai cánh ở 2 chủng có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà tốt nhất có phải đƣợc quy định bởi gen cry2A hay không, đề tài
tiến hành phân lập gen cry2Atừ hai chủng này và nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp, đánh giá khả năng diệt ấu trùng của protein Cry2A tái tổ hợp.
Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen cry2A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc
hiệu đƣợc thiết kế dựa vào các đoạn bảo thủ của gen cry2A đã đƣợc công bố trên ngân hàng thu đƣợc sản phẩm có chiều dài 1902 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Theo các nghiên cứu trƣớc, các chủng mang tinh thể hình thoi có thể có mặt của gen cry1. Kết quả sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho
gen cry1 cũng thể hiện, 7 chủng nghiên cứu có sự xuất hiện của gen cry1 (kết quả không đƣợc thể hiện). Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phƣơng pháp PCR cho thấy, 7 chủng thuộc 2 dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis
serovar israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thƣớc khoảng 1,9 kb (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả PCR sàng lọc các 7 chủng B. thuringiensis bằng cặp mồi khuếch đại gen cry2A
1: LD 2.21; 2: LNT 7.12; 3: LNT 16.6; 4: MSS 1.1; 5: MSS 4.2; 6: MSS 6.3; 7: MSS 8.4; M: Thang DNA chuẩn (HighRanger, Norgenbiotek)
Trong nghiên cứu này, đề tài kiểm tra sự có mặt từ gen cry2A từ 7 chủng, gen
cry2A từ 2 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà cao nhất đƣợc giải trình tự.
3.2.2. ách dịng và đọc trình tự gen cry2A
Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất đƣợc khuếch đại vàgắn vào vector tách dòng PCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coliDH5α.
Sau 14 - 16 giờ cấy trải lên môi trƣờng chọn lọc LB, Ampicilin 50 µg/ml, ở 37oC, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Từ 4 dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu đƣợc đoạn kích thƣớc đúng nhƣ tính tốn (khoảng 1,9 kb) (Hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4
1-4: Sản phẩm PCR dòng biến nạp gen từ chủng LNT7.12; 5-8: Sản phẩm PCR dòng biến nạp gen từ chủng MSS8.4; 9: Đối chứng âm; M: Thang DNA chuẩn
(HighRanger, Norgenbiotek)
Để khẳng định lại kết quả, 3 dịng tế bào mang gen đƣợc mang đi ni lắc và tách DNA plasmid. Plasmid sau khi tách và tinh sạch đƣợc cắt bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI, chính là 2 enzyme đƣợc treo sẵn trình tự nhận biết khi
thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân gen. Nếu vector mang gen chèn sẽ xuất hiện 2 băng trên gel điện di, băng 1,9 kb chính là gen cry2A và băng 3,9 kb chính là kích thƣớc của vector pCR2.1.
Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid của 3 dòng tế bào đều cho 1 băng có kích thƣớc 3,9 kb và 1 băng có kích thƣớc 1,9 kb, đúng nhƣ kích thƣớc tính tốn. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,9 kb đã đƣợc tách dịng thành cơng (Hình 3.9). Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dịng có phải là là gen cry2A hay khơng, trình tự đoạn gen này đƣợc đọc và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
Hình 3.9. Kết quả cắt các dịng biến nạp mang gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4 bằng 2 enzyme BamHI,XhoI
1: DNA plasmid không cắt; 2-4: Sản phẩm cắt các dòng mang gen từ chủng LNT7.12; 5-7: Sản phẩm cắt các dòng mang gen từ chủng MSS8.4; M: Thang DNA
Từ 3 chủng đã tách dòng và sàng lọc thành cơng của mỗi dịng, DNA plasmid của các dịng đƣợc gửi đi đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự tự động (Macrogen, Hàn Quốc) sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Trình tự nucleotide sau khi đọc trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit ver 7.0.9. Các trình tự DNA này sau đó đƣợc so sánh và xác định mối quan hệ với các trình tự gen cry khác trên
Ngân hàng Gen Quốc tế.
Cho đến nay, dựa trên trình tự gene mã hố, độc tố Cry đã đƣợc chia thành ít nhất 70 nhóm, trong đó phổ biến và đƣợc ứng dụng nhiều nhất là các nhóm Cry1, Cry2, Cry3, Cry4 (Bravo, 1997; Bravo và cộng sự, 2012; Crickmore và cộng sự, 1998). Trong nghiên cứu này, đề tài tiến hành xây dựng mối quan hệ di truyền của trình tự gene cry2A thu thập đƣợc với các trình tự tham chiếu nhằm xác định phân nhóm của trình tự gene tổng hợp. Sự sai khác về trình tự axit amin giữa các nhóm gene Cry lên tới 60%, trong khi sự sai khác giữa các phân nhóm nằm trong khoảng từ 30 - 60% (Bravo và cộng sự, 2013). Sự tƣơng đồng về trình tự axit amin giữa các nhánh giao động trong khoảng 5 - 30%. Kết quả xây dựng cây phả hệ cho thấy trình tự thu đƣợc mã hố cho gene thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa (Hình 3.10). Nhóm độc tố cry2Aa và cry4 đã đƣợc chứng minh có khả năng gây độc lên côn
Hình. 3.10. Phân nhóm quan hệ của trình tự DNA phân lập từ chủng MSS8.4 với các trình tự gen cry.
Trình tự DNA của của các gen cry2Aa này tiếp tục đƣợc căn đa chuỗi so
sánh với các trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa trên Ngân hàng Gen Quốc tế. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp và có độ tƣơng đồng là 99% với trình tự tƣơng ứng đã công bố trƣớc đây trên ngân hàng genvới 6 điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G), 1303 (G-A), 1575 (C-T) ( chi tiết tại Hình 3.11), chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng cơng bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên Genbank với mã số là KM588296.
AJ132465.1_Cry2Aa6 AF047038.1_Cry2Aa4 M31738.1_cry2Aa1 M23723.1_Cry2Aa2 LNT7.12 MSS8.4 AJ132464.1_Cry2Aa5 D86064.1_Cry2Aa3 M23724.1_Cry2Ab1 X55416.1_Cry2Ab2 X57252.1_Cry2Ac1 M11250.1_Cry1Aa M13898.1_Cry1ab M11068.1_Cry1ac J02978.1_Cry3aa U31633.1_Cry3bb Y00423.1_Cry4aa1 D00248.1_Cry4aa2 D00247.1_Cry4ba4 X07423.1_Cry4ba1 X07082.1_Cry4ba2 M20242.1_Cry4ba3 9 3 1 0 0 1 0 0 6 0 7 1 1 0 0 1 0 0 9 4 8 2 1 0 0 1 0 0 6 2 1 0 09 9 9 9 0.1
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSS8.4 ATGA ATA ATGTAT TGA ATAGTG GA AGA ACA ACTAT T TGTGATGCGTATA ATGTAGTAGC C CATGATC CAT T TAGT T T TGA ACATA A ATCAT TAGATAC CATC CA A A A AGA ATG GATG GAG M31738.1_cry2Aa1 .... ... ...... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... M23723.1_Cry2Aa2 .... ... ...... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... D86064.1_Cry2Aa3 .... ... ...... ... ....C. .. . A . ... ..... . ...A ......... .......G ..T..C.... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. .G. ... ... .... ... AF047038.1_Cry2Aa4 .... ...G..... ... ...... .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... AJ132464.1_Cry2Aa5 .... ... ...... ... ....C C.. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... AJ132465.1_Cry2Aa6 .... ... ...... ... ....C. .. ... ... ..... . ............. .......... . ....... ... . .... . . ... ..... . ..... ....... .... .. . . . ... ... .... ... M23724.1_Cry2Ab1 .... ...G..... ... ....C. .. ... ..T..... . ............. ......CG ..T....... ... . .... . . .C. ...C. . ..... ....... .G.A.. . . .G .. ... ..C. ... X55416.1_Cry2Ab2 .... ...G..... ... ....C. .. ... ..T..... . ............. ......CG ..T....... ... . .... . . .C. ...C. . ..... ....... .G.A.. . . .G .. ... ..C. ... X57252.1_Cry2Ac1 .... ...C..... ... ... AC. .. ... . AT....C. ...C....AC... ....... T..T....... ... . .... . . ... ..... . ..... .. A .... ...AG. . . . ... ... .. A A.. A 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
MSS8.4 TG GA A A AGA ACAGATCATAGT T TATATGTAGCTC CTGTAGTCG GA ACTGTGTCTAGT T T T T TGCTA A AGA A AGTG G G GAGTCT TAT TG GA A A A AG GATAT TGAGTGA AT TATG G G G GATA
M31738.1_cry2Aa1 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... M23723.1_Cry2Aa2 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... D86064.1_Cry2Aa3 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . .C..... . ... . .... . . ......A .. .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .T .. AF047038.1_Cry2Aa4 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... AJ132464.1_Cry2Aa5 .. .. . . ... ............ . ............ ......... .. ............ . . . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... AJ132465.1_Cry2Aa6 .. ..G. ... ............ . ............ ......... .. ............ . . . . ..... . ... . .... . . ...... ... .. .. . . . .. ..... ....... .. .... . . . .... M23724.1_Cry2Ab1 .. .. . . . A . . ATA ........ . ....C C...A.. ..A. T.. T. .. ...... G..... . . .C..T .. . ... . .... . . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.A .....G. ..C. .A AT T .. X55416.1_Cry2Ab2 .. .. . . . A . . ATA ........ . ....C C...A.. ..A. T.. T. .. ...... G..... . . .C..T .. . ... . .... . . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.A .....G. ..C. .A AT T .. X57252.1_Cry2Ac1 .. .. . . ... ..T......... . .......... C . ..A. T..G . .. ...... G G.... . . .C.AT .. . ... . ...A. . ...... .G. .. .. . . . .. ....C.......G. ..CA.A AT T ..