CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Hệ biểu hiện Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli)là vi khuẩn Gram âm, kị khí không bắt buộc và không sinh bào tử. E.coli có bộ máy di truyền tƣơng đối đơn giản. Tế bào E. coli có tốc độ sinh sản nhanh với thời giàn thế hệ trung bình là 22 phút trên những môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, Đặc biệt, E. colicó khả năng thu nhận rất nhiều
các yếu tố di truyền vận động từ mơi trƣờng ngồi nhƣ plasmid, phage với khả năng sao chép DNA rất lớn. Chính vì vậy mà E. coli có khả năng tổng hợp lƣợng lớn
bào, điều này giúp dễ dàng tối ƣu nâng cao sản lƣợng protein tái tổ hợp bằng công nghệ lên men, vì vậy giá thành sản phẩm protein tái tổ hợp giảm đáng kể. Chính vì vậy, E.coli đã đƣợc cải biến để sử dụng nhƣ một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng cũng nhƣ trong việc biểu hiện gen (Lê Trần Bình và cộng sự, 2003).
Hệ biểu hiện E. coli có khả năng định vị protein mục tiêu. Nhiều chủng chủ
đột biến nhờ đó có thể cải tiến việc biểu hiện protein tái tổ hợp hoặc là chủng chủ mã hóa cho các tRNA mang các codon hiếm trong E. coli giúp biểu hiện thành công các protein khó biểu hiện. Cho đến nay, nhiều chủng E. coli đƣợc sử dụng rộng rãi để tạo các chủng tái tổ hợp.
Chủng E. coli BL21 có chứa gen mã hóa cho T7 RNA. Q trình phiên mã giúp tổng hợp một lƣợng lớn protein ngoại lai dƣới sự điều khiển của promoter T7. Nhờ có những cải biến này mà E. coli BL21 đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong
việc biểu hiện gen ngoại lai.
Bên cạnh những đặc điểm có lợi cho q trình biểu hiện gen ngoại lai, hệ biểu hiện E. coli cịn tồn tại một số điểm khó khăn nhƣ sau:
- Một số protein quan tâm đƣợc tạo ra ở dạng gấp nếp không đúng dẫn tới tạo ra các enzyme khơng có hoạt tính, nhƣ tạo ra dạng apoenzyme hoặc dạng khơng hòa tan (inclusion body), ở dạng này các protein khơng có hoạt tính.
- Sự sản sinh protease nội bào trong quá trình biểu hiện, nên một số chủng mang gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp protease (E.coli BL21) thƣờng đƣợc sử dụng trong biểu hiện gen.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET-22b(+) của hãng Novagen làm vector biểu hiện. Vector pET-22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector đƣợc sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E.colido có nhiều ƣu điểm vƣợt trội: Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promoter T7 là một promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao; Protein tái tổ hợp đƣợc chuyển đến khoang chu chất; Q trình phiên mã đƣợc điều hịa bởi lac operator có cơ chế cảm ứng đơn giản nhƣng hiệu quả bởi IPTG; có vùng đa kết nối (multi cloning site: MCS) với
nhiều điểm nhận biết của các enzyme giới hạn, vùng này đặt đứng khung đọc để tiếp nối quá trình dịch mã với đoạn gen ngoại lai chèn vào; Ngay sau vùng đa nối là một đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin Histidine tích điện âm đƣợc gọi là đi His-Tag; Protein tái tổ hợp tạo ra có thể dễ dàng tinh sạch nhờ đuôi His-Tag nằm ngay trƣớc đầu C của protein. Đuôi His-Tag giúp protein tái tổ hợp đƣợc giữ lại nhờ lực hút tĩnh điện giữa đi His-Tag tích điện âm với ion Ni2+ có trong cột tinh sạch. Protein sẽ đƣợc tách ra khỏi cột khi cho qua dung dịch đệm có pH thích hợp. Vì vậy, vector pET khơng chỉ đƣợc thiết kế riêng cho việc biểu hiện protein ngoại lai mà còn rất thuận lợi cho việc tinh sạch protein tái tổ hợp.