Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:
- Ngưỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2 - Kháng thể cao, hiệu giá (HI)>4 log2 - Không được bảo hộ, hiệu giá (HI)<4 log2
3.4.4. Phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
Kháng thể lịng đỏ (IgY) từ trứng của lơ gà thí nghiệm thu theo các tuần sau miễn dịch được tách chiết theo phương pháp của Akita và Nakai (Akita and NaKai, 1992) quy trình thực hiện như sau:
Lịng đỏ trứng gà được hòa tan trong nước với tỷ lệ 1:10, chỉnh pH = 5,5. Ủ hỗn hợp ở 4˚C thu dịch trong. Kháng thể IgY được tủa bằng ammonium sulfate 29% khuấy đều hỗn hợp ở 4˚C trong 4h. Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm thu tủa và tủa được hòa tan lại trong đệm PBS. Dịch kháng thể sau khi tách chiết tiến hành chạy điện di SDS-PAGE để xác định đặc tính của kháng thể IgY thu được.
3.4.5. Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dịng điện. Trong q trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng. Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được phân tách.
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
Hệ thống điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate-SDS được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein.
3.4.5.1. Nguyên tắc
Dùng để phân tách các phân tử protein. Gel được rót vào giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với không khí.
Chiều dài của gel: 10-100 cm.
a. Điện di khơng biến tính
Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách.
Điện di trong môi trường đệm ở pH kiềm (8-9) nhằm để các protein tích điện âm.
Đối tượng: protein
b. Điện di biến tính
Trong điện di biến tính: đệm mẫu và đệm chạy protein được bổ sung thêm các chất sau:
SDS (Sodium dodesyl sulphate): phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 của protein và làm cho cấu trúc hcuooix protein duỗi thẳng ra và tồn bộ phận tử tích điện âm.
Các chất khử: β-mecaptoethanol (β-ME) hay DTT có tác dụng cắt cầu ddisulfide (-S-S-) ở nhiệt độ 95oC-100oC và giúp protein tồn tại ở dạng chuỗi polypeptide tách rời nhau.
Đới tượng: protein.
3.4.5.2.Các bước tiến hành
Mẫu dịch kháng thể IgY được kiểm tra một số đặc tính bằng phương pháp điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide. Các bước thực hiện được mô tả bởi (Laemmli, 1970), các bước cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị bộ đệm
a. Chạy bộ đệm (1 ×): Pha lỗng 100 ml dung dịch gốc 10 × với 900 ml diH2O b. Bộ đệm mẫu: Sử dụng bộ đệm mẫu Laemmli.
Bước 2: Chuẩn bị gel và lắp ráp tế bào điện di: Công thức chuẩn bị resolving gel 10% 0,75 mm -dH2O 4,0 ml -1.5 M Tris pH 8.8 2,5 ml -30 % Acrylamide 3,3 ml -10% SDS 100 µl -10 % APS 100 µl -TEMED 4 µl
Cơng thức chuẩn bị stack gel 5% 0,75 mm -dH2O 2,7 ml
-1.0 M Tris pH 6.8 500 µl -30% Acrylamide 670 µl -10% SDS 40 µl -10% APS 40 µl -TEMED 4 µl a.Lấy lược ra khỏi gel và lắp ráp bể điện di.
b.Lấp đầy các khoang đệm bên trong và bên ngoài với bộ đệm điện di. Đổ đầy khoang đệm phía trên (bên trong) của mỗi lõi bằng 200 ml dung dịch đệm 1×. Đổ đầy khoang đệm phía dưới (bên ngồi) đến vạch chỉ thị cho 2 gel (550 ml) hoặc 4 gel (800 ml) với 1×dung dịch đệm. Khi chạy> 200 V, đổ đầy khoang đệm bên ngoài đến vạch 4 gel (800 ml)
Bước 3: Chuẩn bị các mẫu như được chỉ ra trong bảng dưới đây (Thể tích mỗi giếng 10 µl)
Thành phần
Mẫu 5 µl 2x non-reducing sample bufer 5 µl
--------------------------------------------------------------------------------------- Tổng khối lượng 10 µl
Bước 4: Ủ 90-100 °C trong 5 phút (hoặc ở 70 °C trong 10 phút).
Bước 5: Chuyển 10 µl mỗi mẫu vào các giếng
Bước 6: Kết nối tế bào điện di với nguồn điện và thực hiện điện di theo các điều kiện sau.
Điều kiện chạy: 180 V Thời gian chạy: 60 phút
Những điều kiện này dành cho gels Tris-HCL SDS-PAGE.
Bước 7: Sau khi điện di hoàn tất, tắt nguồn điện và ngắt kết nối các dây dẫn điện. Mở hộp gel và loại bỏ gel bằng cách thả nó ra khỏi đĩa vào nước
Nhuộm gel và hình ảnh gel, sử dụng một trong các giao thức.
3.4.6.Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị Newcastle
Sử dụng trực tiếp can thiệp vào ổ dịch
Những đàn khi nổ dịch Newcastle hoặc Gumboro được trại tiến hành tiêm trực tiếp vào ổ dịch theo quy trình 2 mũi/2 ngày liền với liều 1-2 ml/con tùy theo đàn khi nổ dịc
Nâng cao khả năng miễn dịch và sức đề kháng cho đàn
Sử dụng kháng thể trong để xử lý tình huống đối với những đàn gà có sức khỏe khơng tốt, thường xun gặp các hiện tượng hen khẹc hoặc một số cá thể trong đàn đáp ứng miễn dịch với vaccine Newcastle khơng tốt vẫn có biểu hiện bệnh nhưng tỷ lệ thấp.
3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu được xử lý,tính tốn bằng chương trình Word và Excel 2010 trên máy tính.
Cơng thức tính HGKTTB log2 HGKTTB log2
Cơng thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể với virus Newcastle:
Tỷ lệ bảo hộ % = × 100%
Cơng thức tính số lượng trứng trung bình 1 ngày trong 1 tuần:
Số lượng trứng trung bình 1 ngày =
Cơng thức tính tỷ lệ đẻ của gà:
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ NEWCASTLE TRONG HUYẾT THANH GÀ TRƯỚC KHI GÂY MIỄN DỊCH TRONG HUYẾT THANH GÀ TRƯỚC KHI GÂY MIỄN DỊCH
Mục đích của việc tiêm vaccine Newcastle là tạo miễn dịch chủ động cho gà chống lại virus Newcastle, do đó để tạo được miễn dịch tốt cho gà cần phải tuân thủ đúng theo quy trình, kỹ thuật hồ sơ của nhà sản xuất.
Trước khi tiến hành tiêm vaccine cho gà thí nghiệm, lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể chống bệnh Newcastle của gà đã có từ trước khi tiêm, từ đó đánh giá so sánh với hàm lượng kháng thể của gà sau khi tiêm vaccine kết hợp với virus cường độc vô hoạt.
Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.1 dưới đây.
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà hậu bị mới bắt về trước khi gây miễn dịch
Lô Tuần tuổi Số mẫu HGKT log2 HGK TTB log2 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) 4 5 6 7 8 9 10 11 TN I 16 10 0 0 0 0 0 2 2 6 10,4 10 100 TN II 16 10 0 0 0 0 0 3 1 6 10,3 10 100 ĐC 16 5 0 0 0 0 0 1 3 1 10 5 100
Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể (HGKT) cho thấy cả lơ thí nghiệm và lơ đối chứng trong máu của gà đều đã có kháng thể chống bệnh Newcastle, 100% mẫu huyết thanh kiểm tra đều có kháng thể Newcastle. HGKTTB của gà ở lô TN I, lô TN II và lô đối chứng lần lượt là: 10,4 log2; 10,3 log2 và 10 log2. Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nơng thơn, hiệu giá HI>4 log2 thì con vật có ngưỡng bảo hộ cao. Thơng qua kết quả ở bảng 4.1, ta có thể thấy tỷ lệ bảo hộ của đàn gà thí nghiệm đạt 100% ở mức bảo hộ cao.
Như vậy trong huyết thanh của đàn gà thí nghiệm khi bắt về đã có kháng thể và đều được bảo hộ với bệnh Newcastle.
4.2. KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ NEWCASTLE TRONG HUYẾT THANH GÀ SAU KHI GÂY MIỄN DỊCH THANH GÀ SAU KHI GÂY MIỄN DỊCH
4.2.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà sau khi gây miễn dịch gây miễn dịch
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lơ gà thí nghiệm I, thí nghiệm II và lơ đối chứng
Lơ gà Thời gian lấy mẫu (Tuần) Số mẫu kiểm tra HGKT (log2) HGKTTB (log2) Tỉ lệ bảo hộ (%) 4 5 6 7 8 9 10 11 TN I 3 10 0 0 0 0 0 1 2 7 10,6 100 5 10 0 0 0 0 0 1 1 8 10,7 100 7 10 0 0 0 0 0 1 0 9 10,8 100 9 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 11 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 13 10 0 0 0 0 0 0 0 10 11 100 15 10 0 0 0 0 0 0 0 10 11 100 TN II 3 10 0 0 0 0 0 2 2 6 10,4 100 5 10 0 0 0 0 0 1 1 8 10,7 100 7 10 0 0 0 0 0 0 2 8 10,8 100 9 10 0 0 0 0 0 1 0 9 10,8 100 11 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 13 10 0 0 0 0 0 1 2 7 10,6 100 15 10 0 0 0 0 0 2 3 5 10,3 100 ĐC 3 5 0 0 0 0 0 0 3 2 10,4 100 5 5 0 0 0 0 0 1 2 2 10,2 100 7 5 0 0 0 0 0 3 2 0 9,4 100 9 5 0 0 0 0 1 0 4 0 9,6 100 11 5 0 0 0 0 1 2 2 0 9,2 100 13 5 0 0 0 1 2 2 0 0 8,2 100 15 5 0 0 0 1 4 0 0 0 7,8 100
Tại các thời điểm 3; 5; 7; 9; 11; 13; 15 tuần sau khi tiêm vaccine lần 1, lấy máu kiểm tra HGKT Newcastle ở đàn gà thí nghiệm cùng với mẫu máu ở lô đối chứng. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.2 và biểu diễn trong biểu đồ 4.1.
Qua bảng 4.2 cho thấy rằng: - Ở lô TN I:
Sau tiến hành gây miễn dịch HGKTTB tăng từ 10,4 log2 ở tuần thứ 1 lên 10,6 log2 ở tuần thứ 3. Hiệu giá kháng thể tiếp tục tăng ở các thời điểm 5-7 tuần sau khi tiêm và đạt ở mức 10,8 log2 ; 10,9 log2 sau khi tiêm vaccine mũi thứ 3 và 4. Ở tuần thứ 9 và 11 lô gà được tiêm vaccine kết hợp với virus cường độc vô hoạt cho kết quả HGKTTB vẫn tiếp tục tăng và đạt cao nhất ở tuần thứ 13 và 15 với hiệu giá kháng thể đạt 11 log2 .
- Lô TN II:
Kết quả kiểm tra sau khi gây miễn dịch cho thấy hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh liên tục tăng ở các tuần 3, 5, 7 với kết quả tương ứng là 10,4 log2, 10,7 log2, 10,8 log2 và đạt cao nhất vào tuần thứ 11 có hiệu giá kháng thể đạt 10,9 log2. Sau thời điểm trên HGKTTB Newcastle ở lô gà TN II khơng được duy trì là liên tục giảm xuống theo thời gian và đạt 10,3 log2 ở tuần thứ 15.
- Lô đối chứng:
Gà được chăm sóc cùng điều kiện với 2 lơ thí nghiệm hiệu giá kháng thể trung bình đạt 10 log2 ở tuần 1 tuy nhiên gà không được tiếp tục gây miễn dịch bằng vaccine hay virus Newcastle cường độc vô hoạt và kết quả cho thấy hiệu giá kháng thể khơng được duy trì qua thời gian và liên tục giảm ở các tuần 3, 5, 7, 9, 11 và đến tuần thứ 15 hiệu giá kháng thể trung bình chỉ đạt 7,8 log2.
Có thể nhận thấy rằng HGKTTB Newcastle của gà ở lô TN I và II tăng lên rõ so gà lô đối chứng. Ngược lại, ở lô đối chứng hàm lượng HGKTTB ổn định rồi giảm dần từ 10,4 log2 từ tuần thứ 3 xuống còn 9,2 log2 ở tuần thứ 11 và đạt 7,8 log2 ở tuần thứ 15 (tính từ sau tiêm vaccine lần 1).
Như vậy sự hình thành kháng thể trong huyết thanh của gà tăng lên sau mỗi lần tiêm miễn dịch, khi ngừng gây miễn dịch thì hàm lượng kháng thể ổn định và giảm dần theo thời gian. Một lần nữa có thể thấy được sự khác biệt rõ ràng trong sự biến động hàm lượng kháng thể Newcastle ở gà lô TN I (lô được tiêm vaccine và virus cường độc vô hoạt), lô TN II (lô tiêm vaccine) so với lô ĐC (không tiêm) qua biểu đồ 4.1.
Biểu đồ 4.1. Biến động hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà lơ thí nghiệm (TN I, TN II) và lô đối chứng
4.3. KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ NEWCASTLE TRONG LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ ĐƯỢC GÂY MIỄN DỊCH ĐỎ TRỨNG GÀ ĐƯỢC GÂY MIỄN DỊCH
4.3.1. Kết quả theo dõi tỷ lệ trứng của gà
Qua bảng 4.3 cho thấy: gà Isa Brown bắt đầu rơi trứng ở tuần tuổi thứ 20, tuổi đẻ đạt 4% ở tuần tuổi thứ 22 và tuần tuổi thứ 25 là 48%. Tỷ lệ đẻ tăng nhanh từ tuần đẻ thứ nhất đến tuần để thứ 6. Tỷ lệ đẻ đạt cao nhất là 88% ở tuần tuổi thứ 30 và được duy trì khoảng 3 tuần sau đó bắt đầu giảm dần.
Kết quả của chúng tôi khá tương đồng nghiên cứu của Tống Minh Phương và cs trong nghiên cứu “ Khả năng sản suất trứng của gà Isa Brown và Ai Cập ni tại n Định Thanh Hóa”.Trong nghiên cứu của Tống Minh Phương và cs đăng trong Tạp chí Khoa Học, Đại học Hồng Đức, số 30. 2016 đã chỉ ra rằng: Gà Isa Brown có tuổi đẻ quả trứng đầu tiên là 143 ngày; tỷ lệ đẻ 5% ở 155 ngày; tỷ lệ đẻ 50% ở 179 ngày và ở 210 ngày với tỷ lệ đẻ cao nhất là 90,26%. Tỷ lệ đẻ đạt cao nhất trong thí nghiệm có thấp hơn so với Tống Minh Phương nghiên cứu một chút, điều này có thể lý giải thơng qua chế độ chăm sóc, ni dưỡng khác nhau.
Bảng 4.3. Theo dõi tình hình đẻ của gà
Tuần tuổi Số lượng trứng trung
bình 1 ngày (quả) Tổng số gà ( con) Tỷ lệ đẻ (%) 20 0,57 25 2,3 21 0,86 25 3,4 22 1 25 4 23 5,1 25 20,4 24 8 25 32 25 12 25 48 26 14,3 25 57,2 27 17 25 68 28 20 25 80 29 21,3 25 85,2 30 22 25 88 31 21,5 25 86 32 22 25 88 33 21 25 84 34 20 25 80 35 19 25 76
Tỷ lệ đẻ của đàn gà sau khi tiêm vaccine có giảm nhẹ trong một hai ngày sau khi tiêm vaccine. Tuy nhiên khi xét trên số lượng trứng trung bình trong một ngày mà tuần đó thu được thì tỷ lệ đẻ của gà không giảm. Như vậy trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch cho gà bằng vaccine Nobilis Cor4+IB+ND+EDS ở nghiên cứu này không làm ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ đẻ của gà. Có thể do quy mơ đàn q nhỏ nên sự ảnh hưởng đến tỷ lệ đẻ của việc tiêm vaccine chưa thực sự là rõ ràng. Đối với quy mô đàn lớn, việc tiêm vaccine cho gà đẻ có thể làm ảnh hưởng đến tỷ lệ đẻ của gà, mức độ ảnh hưởng nhiều hay ít sẽ phụ thuộc vào quy mô đàn, loại vaccine, kỹ thuật tiêm. Do vậy nên tiến hành nghiên cứu với một quy mô đàn lớn hơn để đánh giá được mức độ ảnh hưởng của việc tiêm vaccine đến tỷ lệ đẻ của đàn gà thí nghiệm.
4.3.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong lòng đỏ trứng của gà sau khi gây miễn dịch khi gây miễn dịch
Song song với việc xác định HGKT Newcastle trong huyết thanh của gà đẻ đã được gây miễn dịch, chúng tôi tiến hành xác định HGKT Newcastle trong lòng đỏ trứng. Tiến hành thu trứng lấy lòng đỏ và kiểm tra HGKT Newcastle bằng phản ứng HI tại các thời điểm 7; 9; 11; 13; 15 tuần sau khi tiêm vaccine lần 1. Đối với mỗi lô TN lấy ngẫu nhiên 3 quả trứng, lô đối trứng lấy 2 quả. Chúng tôi bắt đầu thu trứng để xác định HGKT khi gà được 23 tuần tuổi (khi tỷ lệ đẻ