Nguyên liệu
Giếng
1 2 3 4 5 ( ĐC)
PBS (µl) 25 25 25 25 25
4HA (µl) 25 Trộn đều, chuyển 25µl từ giếng thứ 1
đến giếng thứ 4 rồi hút bỏ 25µl 0
PBS (µl) 25 25 25 25 25
Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V. Bổ sung 25µl PBS từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 5. Thêm 25 µl kháng nguyên 4HA đã pha vào giếng thứ nhất, trộn đều với PBS ở giếng thứ 1, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 trộn đều. Tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 4, hút bỏ 25 µl ở giếng thứ 4. Giếng thứ 5 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu.
Nhỏ thêm 25 µl PBS vào tất cả các giếng rồi thêm vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%. Để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút đọc kết quả.
- Kết quả: Nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy là kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Ngược lại , nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên thì kháng ngun pha lỗng. Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc PBS để có kháng nguyên 4HA chuẩn.
Cách tiến hành phản ứng HI
Bảng 3.4. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể chủ động của gà sau khi gây miễn dịch
Nguyê n liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (ĐC) PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh 25
Trộn đều, chuyển 25 µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi hút
bỏ 25 µl 0 KN 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phịng Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng HT
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V, cho 25µl PBS vào mỗi giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng thứ 1. Pha loãng huyết thanh: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng thứ 1, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 11, rồi hút bỏ 25 µl đi ở giếng thứ 11.
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11, mỗi giếng 25 µl. Giếng 12 cho thêm 25 µl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phút, để ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút đọc kết quả ( không đọc muộn hơn 30 phút).
Cách tiến hành phản ứng HI thơng qua lịng đỏ trứng pha loãng
Pha lỗng lịng đỏ trứng:
Tiến hành đập trứng nhẹ nhàng tách lấy phần lòng đỏ sau khi đã loại bỏ hồn tồn phần lịng trắng. Xé nhẹ màng lòng đỏ, thu lòng đỏ vào ống fancol 50, rồi dùng pipet lấy khoảng 100 µl lịng đỏ ra ống ependoft 1,5 ml để pha lỗng. Ta sẽ pha loãng lịng đỏ 5 lần, như vậy hút thêm 400µl PBS 1x vào ống ependoft 1,5 ml đã có lịng đỏ rồi vontex đều.
Bảng 3.5. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể thụ động chuyền qua lòng đỏ trứng Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (ĐC) PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Lịng đỏ trứng đã pha lỗng
25 Trộn đều, chuyển 25 µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi
hút bỏ 25 µl 0 KN 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phịng Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng LĐT
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V, cho PBS vào mỗi giếng 25µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 µl lịng đỏ trứng đã pha loãng cần kiểm tra vào giếng thứ 1. Pha lỗng lịng đỏ trứng: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng thứ 1, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 11, rồi hút bỏ 25 µl đi ở giếng thứ 11.
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11, mỗi giếng 25 µl. Giếng 12 cho thêm 25 µl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phút, để ở nhiệt độ phịng. Sau 30 phút đọc kết quả ( khơng đọc muộn hơn 30 phút).
Đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha lỗng cao nhất có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
- Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ khơng có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng.
Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha lỗng huyết thanh cao nhất cịn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Đánh giá phản ứng: Thông qua hiệu giá của phản ứng người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn gà. Hiệu giá phản ứng từ 1/8 trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle. Hiệu giá HI càng cao thì gà có mức độ miễn dịch càng mạnh.
Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:
- Ngưỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2 - Kháng thể cao, hiệu giá (HI)>4 log2 - Không được bảo hộ, hiệu giá (HI)<4 log2
3.4.4. Phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
Kháng thể lịng đỏ (IgY) từ trứng của lơ gà thí nghiệm thu theo các tuần sau miễn dịch được tách chiết theo phương pháp của Akita và Nakai (Akita and NaKai, 1992) quy trình thực hiện như sau:
Lịng đỏ trứng gà được hòa tan trong nước với tỷ lệ 1:10, chỉnh pH = 5,5. Ủ hỗn hợp ở 4˚C thu dịch trong. Kháng thể IgY được tủa bằng ammonium sulfate 29% khuấy đều hỗn hợp ở 4˚C trong 4h. Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm thu tủa và tủa được hòa tan lại trong đệm PBS. Dịch kháng thể sau khi tách chiết tiến hành chạy điện di SDS-PAGE để xác định đặc tính của kháng thể IgY thu được.
3.4.5. Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dịng điện. Trong q trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng. Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được phân tách.
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
Hệ thống điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate-SDS được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein.
3.4.5.1. Nguyên tắc
Dùng để phân tách các phân tử protein. Gel được rót vào giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với khơng khí.
Chiều dài của gel: 10-100 cm.
a. Điện di khơng biến tính
Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách.
Điện di trong môi trường đệm ở pH kiềm (8-9) nhằm để các protein tích điện âm.
Đối tượng: protein
b. Điện di biến tính
Trong điện di biến tính: đệm mẫu và đệm chạy protein được bổ sung thêm các chất sau:
SDS (Sodium dodesyl sulphate): phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 của protein và làm cho cấu trúc hcuooix protein duỗi thẳng ra và tồn bộ phận tử tích điện âm.
Các chất khử: β-mecaptoethanol (β-ME) hay DTT có tác dụng cắt cầu ddisulfide (-S-S-) ở nhiệt độ 95oC-100oC và giúp protein tồn tại ở dạng chuỗi polypeptide tách rời nhau.
Đới tượng: protein.
3.4.5.2.Các bước tiến hành
Mẫu dịch kháng thể IgY được kiểm tra một số đặc tính bằng phương pháp điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide. Các bước thực hiện được mô tả bởi (Laemmli, 1970), các bước cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị bộ đệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Chạy bộ đệm (1 ×): Pha lỗng 100 ml dung dịch gốc 10 × với 900 ml diH2O b. Bộ đệm mẫu: Sử dụng bộ đệm mẫu Laemmli.
Bước 2: Chuẩn bị gel và lắp ráp tế bào điện di: Công thức chuẩn bị resolving gel 10% 0,75 mm -dH2O 4,0 ml -1.5 M Tris pH 8.8 2,5 ml -30 % Acrylamide 3,3 ml -10% SDS 100 µl -10 % APS 100 µl -TEMED 4 µl
Cơng thức chuẩn bị stack gel 5% 0,75 mm -dH2O 2,7 ml
-1.0 M Tris pH 6.8 500 µl -30% Acrylamide 670 µl -10% SDS 40 µl -10% APS 40 µl -TEMED 4 µl a.Lấy lược ra khỏi gel và lắp ráp bể điện di.
b.Lấp đầy các khoang đệm bên trong và bên ngoài với bộ đệm điện di. Đổ đầy khoang đệm phía trên (bên trong) của mỗi lõi bằng 200 ml dung dịch đệm 1×. Đổ đầy khoang đệm phía dưới (bên ngồi) đến vạch chỉ thị cho 2 gel (550 ml) hoặc 4 gel (800 ml) với 1×dung dịch đệm. Khi chạy> 200 V, đổ đầy khoang đệm bên ngoài đến vạch 4 gel (800 ml)
Bước 3: Chuẩn bị các mẫu như được chỉ ra trong bảng dưới đây (Thể tích mỗi giếng 10 µl)
Thành phần
Mẫu 5 µl 2x non-reducing sample bufer 5 µl
--------------------------------------------------------------------------------------- Tổng khối lượng 10 µl
Bước 4: Ủ 90-100 °C trong 5 phút (hoặc ở 70 °C trong 10 phút).
Bước 5: Chuyển 10 µl mỗi mẫu vào các giếng
Bước 6: Kết nối tế bào điện di với nguồn điện và thực hiện điện di theo các điều kiện sau.
Điều kiện chạy: 180 V Thời gian chạy: 60 phút
Những điều kiện này dành cho gels Tris-HCL SDS-PAGE.
Bước 7: Sau khi điện di hoàn tất, tắt nguồn điện và ngắt kết nối các dây dẫn điện. Mở hộp gel và loại bỏ gel bằng cách thả nó ra khỏi đĩa vào nước
Nhuộm gel và hình ảnh gel, sử dụng một trong các giao thức.
3.4.6.Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị Newcastle
Sử dụng trực tiếp can thiệp vào ổ dịch
Những đàn khi nổ dịch Newcastle hoặc Gumboro được trại tiến hành tiêm trực tiếp vào ổ dịch theo quy trình 2 mũi/2 ngày liền với liều 1-2 ml/con tùy theo đàn khi nổ dịc
Nâng cao khả năng miễn dịch và sức đề kháng cho đàn
Sử dụng kháng thể trong để xử lý tình huống đối với những đàn gà có sức khỏe khơng tốt, thường xuyên gặp các hiện tượng hen khẹc hoặc một số cá thể trong đàn đáp ứng miễn dịch với vaccine Newcastle khơng tốt vẫn có biểu hiện bệnh nhưng tỷ lệ thấp.
3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu được xử lý,tính tốn bằng chương trình Word và Excel 2010 trên máy tính.
Cơng thức tính HGKTTB log2 HGKTTB log2
Cơng thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể với virus Newcastle:
Tỷ lệ bảo hộ % = × 100%
Cơng thức tính số lượng trứng trung bình 1 ngày trong 1 tuần:
Số lượng trứng trung bình 1 ngày =
Cơng thức tính tỷ lệ đẻ của gà:
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ NEWCASTLE TRONG HUYẾT THANH GÀ TRƯỚC KHI GÂY MIỄN DỊCH TRONG HUYẾT THANH GÀ TRƯỚC KHI GÂY MIỄN DỊCH
Mục đích của việc tiêm vaccine Newcastle là tạo miễn dịch chủ động cho gà chống lại virus Newcastle, do đó để tạo được miễn dịch tốt cho gà cần phải tuân thủ đúng theo quy trình, kỹ thuật hồ sơ của nhà sản xuất.
Trước khi tiến hành tiêm vaccine cho gà thí nghiệm, lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể chống bệnh Newcastle của gà đã có từ trước khi tiêm, từ đó đánh giá so sánh với hàm lượng kháng thể của gà sau khi tiêm vaccine kết hợp với virus cường độc vơ hoạt.
Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.1 dưới đây.
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà hậu bị mới bắt về trước khi gây miễn dịch
Lô Tuần tuổi Số mẫu HGKT log2 HGK TTB log2 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) 4 5 6 7 8 9 10 11 TN I 16 10 0 0 0 0 0 2 2 6 10,4 10 100 TN II 16 10 0 0 0 0 0 3 1 6 10,3 10 100 ĐC 16 5 0 0 0 0 0 1 3 1 10 5 100
Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể (HGKT) cho thấy cả lơ thí nghiệm và lơ đối chứng trong máu của gà đều đã có kháng thể chống bệnh Newcastle, 100% mẫu huyết thanh kiểm tra đều có kháng thể Newcastle. HGKTTB của gà ở lô TN I, lô TN II và lô đối chứng lần lượt là: 10,4 log2; 10,3 log2 và 10 log2. Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thơn, hiệu giá HI>4 log2 thì con vật có ngưỡng bảo hộ cao. Thơng qua kết quả ở bảng 4.1, ta có thể thấy tỷ lệ bảo hộ của đàn gà thí nghiệm đạt 100% ở mức bảo hộ cao.
Như vậy trong huyết thanh của đàn gà thí nghiệm khi bắt về đã có kháng thể và đều được bảo hộ với bệnh Newcastle.
4.2. KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ NEWCASTLE TRONG HUYẾT THANH GÀ SAU KHI GÂY MIỄN DỊCH THANH GÀ SAU KHI GÂY MIỄN DỊCH
4.2.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà sau khi gây miễn dịch gây miễn dịch
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lơ gà thí nghiệm I, thí nghiệm II và lơ đối chứng
Lô gà Thời gian lấy mẫu (Tuần) Số mẫu kiểm tra HGKT (log2) HGKTTB (log2) Tỉ lệ bảo hộ (%) 4 5 6 7 8 9 10 11 TN I 3 10 0 0 0 0 0 1 2 7 10,6 100 5 10 0 0 0 0 0 1 1 8 10,7 100 7 10 0 0 0 0 0 1 0 9 10,8 100 9 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 11 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 13 10 0 0 0 0 0 0 0 10 11 100 15 10 0 0 0 0 0 0 0 10 11 100 TN II 3 10 0 0 0 0 0 2 2 6 10,4 100 5 10 0 0 0 0 0 1 1 8 10,7 100 7 10 0 0 0 0 0 0 2 8 10,8 100 9 10 0 0 0 0 0 1 0 9 10,8 100 11 10 0 0 0 0 0 0 1 9 10,9 100 13 10 0 0 0 0 0 1 2 7 10,6 100 15 10 0 0 0 0 0 2 3 5 10,3 100 ĐC 3 5 0 0 0 0 0 0 3 2 10,4 100 5 5 0 0 0 0 0 1 2 2 10,2 100 7 5 0 0 0 0 0 3 2 0 9,4 100 9 5 0 0 0 0 1 0 4 0 9,6 100 11 5 0 0 0 0 1 2 2 0 9,2 100 13 5 0 0 0 1 2 2 0 0 8,2 100 15 5 0 0 0 1 4 0 0 0 7,8 100
Tại các thời điểm 3; 5; 7; 9; 11; 13; 15 tuần sau khi tiêm vaccine lần 1, lấy máu kiểm tra HGKT Newcastle ở đàn gà thí nghiệm cùng với mẫu máu ở lô đối chứng. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.2 và biểu diễn trong biểu đồ 4.1.
Qua bảng 4.2 cho thấy rằng: - Ở lô TN I:
Sau tiến hành gây miễn dịch HGKTTB tăng từ 10,4 log2 ở tuần thứ 1 lên 10,6 log2 ở tuần thứ 3. Hiệu giá kháng thể tiếp tục tăng ở các thời điểm 5-7 tuần sau khi tiêm và đạt ở mức 10,8 log2 ; 10,9 log2 sau khi tiêm vaccine mũi thứ 3 và 4. Ở tuần thứ 9 và 11 lô gà được tiêm vaccine kết hợp với virus cường độc vô hoạt cho kết quả