Phần 2 Tổng quan tài liệu
3.3.Vật liệu nghiên cứu
-Vaccine Newcastle: Vaccine vô hoạt nhũ dầu COR4+IB+ND+EDS của công ty Intervet.
-Virus cường độc vô hoạt Newcastle (do Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y-Khoa thú y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam) phân lập từ thực địa.
-Kháng nguyên chuẩn Newcastle (được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
-Gà hậu bị (khỏe mạnh về lâm sàng) giống gà Isa Brown 16 tuần tuổi. -Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đoán, xét nghiệm Newcastle của Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp gây miễn dịch trên gà
Gà sau khi bắt về được chia thành các lơ khác nhau (2 lơ thí nghiệm và 1 lơ đối chứng: Lô TN I gồm 10 con gà Isa Brown được tiêm vaccine Newcastle kết hợp với virus cường độc vô hoạt; lô TN II gồm 10 con gà Isa Brown được tiêm vaccine Newcastle và lô ĐC gồm 5 con gà Isa Brown không tiêm vaccine, ni chung với lơ gà thí nghiệm), chăm sóc và theo dõi sức khỏe trong vịng 1 tuần. Trước khi tiêm vaccine, tiến hành lấy máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể của gà đã có trước đó.
Đường đưa thuốc: tiêm bắp là đường đưa được dùng thường xuyên nhất đối với hầu hết các loại thuốc và vaccine. Thuốc đưa qua đường tiêm bắp được hấp thu vào máu nhanh hơn qua da do hệ thống mạch máu dày đặc trong cơ và sự co duỗi của cơ khi hoạt động giúp thuốc lưu thông tốt hơn.
Vị trí tiêm bắp: tiêm ở vị trí cơ ức.
Bảng 3.1. Quy trình gây miễn dịch cho gà bằng vaccine sau khi bắt về
Tuần tuổi Vaccine Phòng bệnh Nước pha Liều dùng Cách dùng 16 Nobilis Ma5+Clone 30 VPQTN+New Solvence 1 giọt/con Nhỏ mắt
19 Nobilis Cor4+IB+ND+ EDS
Sổ mũi truyền nhiễm+ VPQTN+New+Hội chứng giảm đẻ 0.5 ml/con Tiêm cơ
21 Nobilis Cor4+IB+ND+ EDS
Sổ mũi truyền nhiễm+ VPQTN+New+Hội chứng giảm đẻ 0.5 ml/con Tiêm cơ 23 Nobilis Cor4+IB+ND+ EDS
Sổ mũi truyền nhiễm+ VPQTN+New+Hội trứng giảm đẻ 0.5 ml/con Tiêm cơ 25
Tiêm virus cường độc vô hoạt cho gà ở lô TN I lần 1, Lô II không tiêm. Tiêm virus cường độc vô hoạt cho gà ở lô TN I lần 2, Lô II không tiêm. 27 Không tiêm vaccine hay virus. 29 Không tiêm vaccine hay virus
3.4.2. Phương pháp lấy và bảo quản huyết thanh
Phương pháp lấy máu gà
Vị trí: lấy máu ở tĩnh mạch cánh. Đây là phương pháp tốt và đơn giản nhất đối với gà, gà tây và với hầu hết các loại gia cầm khác nuôi trong điều kiện tự nhiên. Bộc lộ cánh, dùng cồn 70° để sát trùng chỗ lấy máu rồi tiến hành lấy máu.
Cách chắt huyết thanh
Máu gà sau khi lấy xong để ở tủ ấm 37°C 1 giờ rồi để ở 4°C , sau 1-2 giờ lấy ra chắt huyết thanh. Huyết thanh được chắt ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5 phút. Nếu huyết thanh sau khi chắt xong chưa làm ngay thì bảo quản huyết thanh ở tủ âm 20°C.
3.4.3. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể và độ dài đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vaccine bằng phản ứng HI sau khi tiêm vaccine bằng phản ứng HI
Sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) để xác định sự có mặt của virus và phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI) để xác định hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh của gà.
3.4.3.1. Phản ứng HI (phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà) với huyết
thanh, lòng đỏ trứng và sản phẩm IgY
Nguyên lý của phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI:
Đối với gà mắc bệnh Newcastle hoặc đã được tiêm phòng vaccine Newcastle thì trong huyết thanh gà có kháng thể đặc hiệu chống lại virus Newcastle, kháng thể trung hịa virus làm cho nó mất khả năng ngưng kết hồng cầu gà.
a. Nguyên liệu:
- Dung dịch PBS 1X - Hồng cầu gà 1% - Huyết thanh kiểm tra
- Đĩa ngưng kết 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U.
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle (được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Cách pha và chuẩn bị các nguyên liệu
- Cách pha dung dịch PBS 1X từ dung dịch PBS 10X: pha theo tỷ lệ 1 PBS 10X : 9 nước cất.
Ví dụ: Lấy 900 ml nước cất cho vào bình thủy tinh sạch, sau đó cho 100 ml dung dịch PBS 10X rồi lắc đều.
- Cách chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu gà 1%
Gà lấy máu là gà khỏe mạnh, âm tính với kháng thể Newcastle. Ni gà ở chuồng an tồn dịch bệnh, dùng để lấy máu thường xuyên.
Vị trí lấy máu: Lấy máu ở vị trí tĩnh mạch cánh, sát trùng vị trí lấy máu bằng bơng cồn 70°.
Dùng xi lanh 5ml hút khoảng 0.2 ml dung dịch chống đông Natricitrat 5%, rồi dùng xi lanh lấy 3-4ml máu gà.
Rửa hồng cầu: Chuyển máu chống đông vào ống fancol 15 bổ sung thêm dung dịch PBS 1X đến vạch 10ml, lắc nhẹ. Ly tâm ở 1500 vòng trong 5 phút, loại bỏ huyễn dịch ở trên. Lặp lại như trên từ 2 đến 3 lần. Sau lần ly tâm cuối cùng, bỏ huyễn dịch phía trên thu hồng cầu phía dưới sử dụng để pha lỗng.
Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1%. Ví dụ: 1ml hồng cầu đặc với 99 ml dung dịch PBS 1X. Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ từ 4°C-8°C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong một tuần, nếu huyễn dịch hồng cầu bị dung huyết phải loại bỏ. Hồng cầu đã rửa nếu không dùng hết, cần cho nước muối sinh lý hoặc PBS 1X vào bảo quản, khi cần ly tâm lại để dùng.
c. Trình tự tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Xác định lại hiệu giá của kháng nguyên chuẩn Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu- HA ( Hemagglutination test)
Nguyên lý của phản ứng HA:
Trên bề mặt của virus Newcastle có kháng nguyên HN có khả năng gắn với thụ thể của hồng cầu gây ngưng kết hồng cầu, ta có thể quan sát được hiện tượng này bằng mắt thường.
-Nguyên liệu:
+ Hồng cầu gà 1%,
+ Kháng nguyên chuẩn Newcastle + Dung dịch PBS từ 7,0-7,4
+ Đĩa 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U + Bộ dụng cụ pipette, đầu tipe….
Bảng 3.2. Trình tự tiến hành phản ứng HA Nguyên Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ĐC PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên (µl) 25
Trộn đều, chuyển 25 µl từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11
rồi hút bỏ 25 µl 0
Hồng cầu
gà (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Độ pha loãng KN
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ V hoặc chữ U. Bổ sung 25 µl PBS từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 12. Thêm 25 µl kháng nguyên vào giếng thứ nhất
Pha loãng kháng nguyên: Trộn đều kháng nguyên với PBS ở giếng thứ nhất, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ hai rồi trộn đều bằng pipet, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy cho đến giếng thứ 11, hút bỏ 25 µl ở giếng thứ 11. Giếng 12 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu.
Nhỏ thêm 25 µl PBS vào tất cả các giếng.
Thêm hồng cầu: Cho vào mỗi giếng 25µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút đọc kết quả, không nên đọc kết quả sau quá 30 phút.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu giá ngưng kết HA được tính ở độ pha lỗng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hồn tồn. Ví dụ: giếng cuối cùng còn có ngưng kết hồn tồn, hiệu giá HA= 1/256 ( hay 8log2).
Cách pha và chuẩn độ kháng nguyên 4HA(thống nhất cách đánh dấu đầu mục cùng loại)
Ví dụ: Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256 thì 4HA bằng 1/256×4=1/64.
- Pha 4HA gồm 1 phần kháng nuyên và 63 phần PBS 1x. Chuẩn độ kháng nguyên 4HA bằng phản ứng HA.
- Cách chuẩn độ kháng nguyên 4HA:
Bảng 3.3. Trình tự phản ứng HA để chuẩn độ 4 HA
Nguyên liệu
Giếng
1 2 3 4 5 ( ĐC)
PBS (µl) 25 25 25 25 25
4HA (µl) 25 Trộn đều, chuyển 25µl từ giếng thứ 1
đến giếng thứ 4 rồi hút bỏ 25µl 0
PBS (µl) 25 25 25 25 25
Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V. Bổ sung 25µl PBS từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 5. Thêm 25 µl kháng nguyên 4HA đã pha vào giếng thứ nhất, trộn đều với PBS ở giếng thứ 1, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 trộn đều. Tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 4, hút bỏ 25 µl ở giếng thứ 4. Giếng thứ 5 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu.
Nhỏ thêm 25 µl PBS vào tất cả các giếng rồi thêm vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%. Để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút đọc kết quả.
- Kết quả: Nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy là kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Ngược lại , nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên thì kháng nguyên pha loãng. Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc PBS để có kháng nguyên 4HA chuẩn.
Cách tiến hành phản ứng HI
Bảng 3.4. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể chủ động của gà sau khi gây miễn dịch
Nguyê n liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (ĐC) PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh 25
Trộn đều, chuyển 25 µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi hút
bỏ 25 µl 0 KN 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phịng Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng HT
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V, cho 25µl PBS vào mỗi giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng thứ 1. Pha loãng huyết thanh: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng thứ 1, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 11, rồi hút bỏ 25 µl đi ở giếng thứ 11.
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11, mỗi giếng 25 µl. Giếng 12 cho thêm 25 µl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phút, để ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút đọc kết quả ( không đọc muộn hơn 30 phút).
Cách tiến hành phản ứng HI thơng qua lịng đỏ trứng pha loãng
Pha lỗng lịng đỏ trứng:
Tiến hành đập trứng nhẹ nhàng tách lấy phần lòng đỏ sau khi đã loại bỏ hồn tồn phần lịng trắng. Xé nhẹ màng lòng đỏ, thu lòng đỏ vào ống fancol 50, rồi dùng pipet lấy khoảng 100 µl lịng đỏ ra ống ependoft 1,5 ml để pha loãng. Ta sẽ pha loãng lịng đỏ 5 lần, như vậy hút thêm 400µl PBS 1x vào ống ependoft 1,5 ml đã có lịng đỏ rồi vontex đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể thụ động chuyền qua lòng đỏ trứng Nguyên liệu Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (ĐC) PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Lịng đỏ trứng đã pha lỗng
25 Trộn đều, chuyển 25 µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11 rồi
hút bỏ 25 µl 0 KN 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phịng Hồng cầu gà (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng LĐT
Dùng đĩa 96 giếng, đáy chữ U hoặc chữ V, cho PBS vào mỗi giếng 25µl từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12.
Cho 25 µl lịng đỏ trứng đã pha loãng cần kiểm tra vào giếng thứ 1. Pha lỗng lịng đỏ trứng: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng thứ 1, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 11, rồi hút bỏ 25 µl đi ở giếng thứ 11.
Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11, mỗi giếng 25 µl. Giếng 12 cho thêm 25 µl PBS.
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ 1 phút, để ở nhiệt độ phịng. Sau 30 phút đọc kết quả ( khơng đọc muộn hơn 30 phút).
Đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha lỗng cao nhất có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
- Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ khơng có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng.
Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha lỗng huyết thanh cao nhất cịn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Đánh giá phản ứng: Thông qua hiệu giá của phản ứng người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn gà. Hiệu giá phản ứng từ 1/8 trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle. Hiệu giá HI càng cao thì gà có mức độ miễn dịch càng mạnh.
Theo quy định 1362/ KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:
- Ngưỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2 - Kháng thể cao, hiệu giá (HI)>4 log2 - Không được bảo hộ, hiệu giá (HI)<4 log2
3.4.4. Phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
Kháng thể lịng đỏ (IgY) từ trứng của lơ gà thí nghiệm thu theo các tuần sau miễn dịch được tách chiết theo phương pháp của Akita và Nakai (Akita and NaKai, 1992) quy trình thực hiện như sau:
Lòng đỏ trứng gà được hòa tan trong nước với tỷ lệ 1:10, chỉnh pH = 5,5. Ủ hỗn hợp ở 4˚C thu dịch trong. Kháng thể IgY được tủa bằng ammonium sulfate 29% khuấy đều hỗn hợp ở 4˚C trong 4h. Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm thu tủa và tủa được hòa tan lại trong đệm PBS. Dịch kháng thể sau khi tách chiết tiến hành chạy điện di SDS-PAGE để xác định đặc tính của kháng thể IgY thu được.
3.4.5. Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dịng điện. Trong q trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng. Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được phân tách.
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
Hệ thống điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate-SDS được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein.
3.4.5.1. Nguyên tắc
Dùng để phân tách các phân tử protein. Gel được rót vào giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với khơng khí.
Chiều dài của gel: 10-100 cm.
a. Điện di khơng biến tính
Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách.