Phần 2 Tổng quan tài liệu
3.4.5.Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.5.Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
Điện di là quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dòng điện. Trong quá trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó, việc phân tách nhau của các chất là theo khối lượng. Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được phân tách.
Mục đích: dùng để tách, phân tích các phân tử như ADN, ARN hay protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng như: kích thước, hình dạng.
Hệ thống điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate-SDS được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein.
3.4.5.1. Nguyên tắc
Dùng để phân tách các phân tử protein. Gel được rót vào giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với không khí.
Chiều dài của gel: 10-100 cm.
a. Điện di không biến tính
Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách.
Điện di trong môi trường đệm ở pH kiềm (8-9) nhằm để các protein tích điện âm.
Đối tượng: protein
b. Điện di biến tính
Trong điện di biến tính: đệm mẫu và đệm chạy protein được bổ sung thêm các chất sau:
SDS (Sodium dodesyl sulphate): phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 của protein và làm cho cấu trúc hcuooix protein duỗi thẳng ra và toàn bộ phận tử tích điện âm.
Các chất khử: β-mecaptoethanol (β-ME) hay DTT có tác dụng cắt cầu ddisulfide (-S-S-) ở nhiệt độ 95oC-100oC và giúp protein tồn tại ở dạng chuỗi polypeptide tách rời nhau.
Đới tượng: protein.
3.4.5.2.Các bước tiến hành
Mẫu dịch kháng thể IgY được kiểm tra một số đặc tính bằng phương pháp điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide. Các bước thực hiện được mô tả bởi (Laemmli, 1970), các bước cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị bộ đệm
a. Chạy bộ đệm (1 ×): Pha loãng 100 ml dung dịch gốc 10 × với 900 ml diH2O b. Bộ đệm mẫu: Sử dụng bộ đệm mẫu Laemmli.
Bước 2: Chuẩn bị gel và lắp ráp tế bào điện di: Công thức chuẩn bị resolving gel 10% 0,75 mm -dH2O 4,0 ml -1.5 M Tris pH 8.8 2,5 ml -30 % Acrylamide 3,3 ml -10% SDS 100 µl -10 % APS 100 µl -TEMED 4 µl
Công thức chuẩn bị stack gel 5% 0,75 mm -dH2O 2,7 ml
-1.0 M Tris pH 6.8 500 µl -30% Acrylamide 670 µl -10% SDS 40 µl -10% APS 40 µl -TEMED 4 µl a.Lấy lược ra khỏi gel và lắp ráp bể điện di.
b.Lấp đầy các khoang đệm bên trong và bên ngoài với bộ đệm điện di. Đổ đầy khoang đệm phía trên (bên trong) của mỗi lõi bằng 200 ml dung dịch đệm 1×. Đổ đầy khoang đệm phía dưới (bên ngoài) đến vạch chỉ thị cho 2 gel (550 ml) hoặc 4 gel (800 ml) với 1×dung dịch đệm. Khi chạy> 200 V, đổ đầy khoang đệm bên ngoài đến vạch 4 gel (800 ml)
Bước 3: Chuẩn bị các mẫu như được chỉ ra trong bảng dưới đây (Thể tích mỗi giếng 10 µl)
Thành phần
Mẫu 5 µl 2x non-reducing sample bufer 5 µl
--- Tổng khối lượng 10 µl
Bước 4: Ủ 90-100 °C trong 5 phút (hoặc ở 70 °C trong 10 phút).
Bước 5: Chuyển 10 µl mỗi mẫu vào các giếng
Bước 6: Kết nối tế bào điện di với nguồn điện và thực hiện điện di theo các điều kiện sau.
Điều kiện chạy: 180 V Thời gian chạy: 60 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Những điều kiện này dành cho gels Tris-HCL SDS-PAGE.
Bước 7: Sau khi điện di hoàn tất, tắt nguồn điện và ngắt kết nối các dây dẫn điện. Mở hộp gel và loại bỏ gel bằng cách thả nó ra khỏi đĩa vào nước
Nhuộm gel và hình ảnh gel, sử dụng một trong các giao thức.