Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.6. Phương pháp PCR
PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ gà mắc bệnh. Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA- polymerase phù hợp.
3.5.6.1. Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng
lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
3.5.6.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: Nội dung Thể tích (µl) Nuclease-Free Water 6,5 Master Mix 12,5 Reverse Primer 0,5 Forward Primer 0,5
Mẫu DNA tách chiết 5
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Charlton et al., 1993).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xi GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G
784bp
Mồi ngược TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu trình nhiệt:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.5.6.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 10ml dung dịch TBE 1X, đun sơi trong lị vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung 10µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl marker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.