2.6.1. Phòng bệnh
+ Quy trình chăm sóc
ORT gây bệnh với tỷ lệ bùng phát thành dịch khá cao và các tiêu chuẩn nghiêm ngặt về an toàn sinh học nên được sử dụng để ngăn chặn lây lan ra toàn đàn. Tuy nhiên sau khi toàn trang trại đã bị nhiễm, ORT trở thành dịch địa phương, đặc biệt là ở các trang trại nhiều lứa gà trong cùng một khu vực và trang trại chăn nuôi với mật độ chăn nuôi lớn (Roepke et al., 1998; Hafez and Schulze, 2003).
+ Phòng bệnh bằng vacxin
Phòng bệnh bằng vacxin trên gà thịt bằng vacxin vô hoạt được khuyến cáo là hiệu quả (van Empel, 1998; Van Veen et al., 2004). Nhưng đương nhiên nó không có tính thực tiễn ở các gà thương phẩm. Vacxin dành cho gà thịt giống là vacxin vô hoạt bổ sung kích thích sản sinh kháng thể cho gà bố mẹ (Cauwerts et al., 2002; Bisschop et al., 2004), đủ để bảo vệ đàn gà con cháu khi công cường độc thí nghiệm ở gà trên 4 tuần (van Empel, 1998) và làm giảm tỷ lệ chết cũng như tỷ lệ mắc lại ở thế hệ gà con cháu từ người nuôi. Hơn nữa, việc sử dụng cách phun đối với vacxin sống ở 14 ngày tuổi kết quả cho tỷ lệ viêm túi khí và viêm phổi thấp nhất khi công cường độc.
Schuijffel et al. (2005) đã chứng minh rằng khả năng tạo miễn dịch chéo chống lại các chủng ORT khác nhau có thể được sinh ra nhờ tiêm vacxin sống ở gia cầm. Các gen mã hóa 8 kháng nguyên tạo phản ứng chéo được khuếch đại, nhân bản trong một vector biểu hiện, đưa vào E.Coli. Protein tái tổ hợp với một khối lượng phân tử nằm trong khoảng 35,9-62,9 kDa được trọn lẫn và thử nghiệm như một loại vacxin.
Sprenger et al. (1998) đã chủng vacxin cho gà tây 6 tuần tuổi với một loại vacxin sống hoặc tiêm dưới da với một loại vaccine ORT vô hoạt và công cường độc bằng đường khí quản với ORT sống ở 14 hoặc 21 tuần tuổi. Hiện tượng viêm túi khí và viêm phổi thường thấy thấp hơn so với các gà không chủng vacxin sau công cường độc; ORT lưu lại trong đàn gà không chủng vacxin ở nhóm chủng vacxin thì không hoặc gà không công cường độc.
Một chủng đột biến do nhạy cảm với nhiệt độ của ORT được phát triển và được sử dụng như vacxin sống cho đàn gà tây (Lopes et al., 2002). Đàn gà tây
được sử dụng vacxin lúc 5 ngày tuổi qua đường nước uống và công cường độc sau 7 ngày dùng vacxin. Những con được dùng vacxin có những biểu hiện bệnh tích đại thể được đánh giá thấp hơn đáng kể, cũng như một tỷ lệ thấp hơn bị phân lập lại và số lượng thấp hơn đơn vị khác của ORT ở mỗi gram mô phổi so với những con không dùng vacxin, có khả năng bảo hộ cho gà tây nhưng không thí nghiệm kiểm chứng nào được thực hiện mà cho kết quả là có giá trị và hiệu quả, tính an toàn của chủng này (Hafez et al., 1999).
Chủng vacxin cho gà tây với chủng tự sinh vô hoạt đã thành công trong việc làm giảm sự bùng phát dịch ORT trên gà tây ở Israel (Bock et al., 1997).
Roepke (1996) đã sử dụng một chủng vacxin sống tư sinh theo đường uống cho gà tây ở 6 tuần tuổi kết quả cho thấy cũng có hiệu quả làm giảm mức độ tổn thương và tỷ lệ gây chết khi chúng trưởng thành. Điều rất thú vị ở đây là ngay sau đó đàn gà này được chủng bằng đường phun sương với vacxin sống phòng bệnh Newcastle mà không gặp bất kỳ vấn đề gì.
Do khả năng gây nhiễm với rất nhiều chủng khác nhau nên việc sử dụng nhiều chủng vi khuẩn trong vacxin là rất cần thiết.
2.6.2. Điều trị
Nói chung, các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn trong chăn nuôi gia cầm có thể được điều trị hoặc kiểm soát bằng kháng sinh kết hợp với các biện pháp vệ sinh. Tuy nhiên, việc điều trị ORT bằng kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn bởi rất nhiều chủng của ORT có khả năng làm giảm độ nhạy hoặc có tính kháng cao với nhiều loại kháng sinh. Tính nhậy cảm với thuốc kháng sinh của ORT phụ thuộc vào các loài gia cầm mắc bệnh và vùng địa lý. Các chủng ORT phân lập ở Châu Âu thường đề kháng với Trimethoprim/Sulphonamide, Gentamycin, Spectinomycin, Neomycin, Enrofloxacin và Colistin (Van Beek, 1994; Hafez, 1996; van Empel, 2002) nhạy cảm với Ampicillin, Ceftiofur, Doxycyline, Lincomycin, Tetracycline, Chloramphenicol, Amoxycillin, Penicillin và Tylosin (Hafez, 1996). Ở hầu hết các vùng trên thế giới, ORT nhạy cảm với Doxycycline và Tetracycline (Van Beek, 1994; Hafez, 1996). Tính nhạy cảm với kháng sinh còn phụ thuộc vào chế độ sử dụng kháng sinh ở ngành chăn nuôi gia cầm ở các quốc gia, khu vực khác nhau. Ví dụ: ở một số quốc gia, trứng thường được nhúng vào một loại kháng sinh như Enrofloxacin thì gần như tất cả các chủng sẽ có thể kháng với kháng sinh đó.
Năm 2002, Hafez báo cáo rằng cho uống Amoxicillin pha với liều 250ppm cho 3 – 7 ngày cho kết quả khá tốt ở nhiều trường hợp và việc sử dụng Chlortetracycline với liều 500ppm pha nước uống 4 – 5 ngày cũng cho hiệu quả. Một vài trường hợp, tiêm Tetracycline và Penicillin cũng cho hiệu quả cao.
Ngoài ra, theo một số nghiên cứu ở các nước như Đức, Mỹ thì các chủng phân lập ở mỗi nước sẽ có độ mẫn cảm khác nhau với một số loại kháng sinh như Ampicillin, Erythromycin, Tylosin, Neomycin,…(Hinz et al., 1994). Khi gây bệnh nhẹ, ở giai đoạn đầu chỉ cần cho tổng đàn uống kháng sinh Amoxycilin hoặc Ampicillin với liều 25mg/ kg thể trọng liên tục trong 3 – 5 ngày. Nếu bệnh tiến triển nhanh và nặng thì ngoài việc cho uống kháng sinh với liều lượng và liệu trình như trên cần phải tiêm thêm Gentamycine với liều 8mg/ kg thể trọng.
Trong điều trị bệnh do ORT, việc chăm sóc tốt và bổ sung các vitamin và khoáng chất rất quan trọng. Việc giữ cho tiểu khí hậu chuồng nuôi, môi trường xung quanh được thông thoáng, sạch sẽ là rất cần thiết, giúp công tác điều trị bệnh đạt hiệu quả cao.
PHẦN 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Huyện Ba Vì - Hà Nội
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 – Khoa Thú Y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
3.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Gà thả vườn Ba Vì ở các nhóm tuổi khác nhau nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ, trang trại chăn nuôi ở huyện Ba Vì – Hà Nội.
3.3. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Tháng 10/2016 đến tháng 9/2017.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT - Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR
- Các triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT - Những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh do ORT
Một số đặc điểm dịch tễ của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT
Điều tra tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà theo lứa tuổi, mùa vụ và truyền thống chăn nuôi.
Biện pháp phòng và trị bệnh
- Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh
- Xác định tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh và thử nghiệm điều trị
- Xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 3.5.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi nhiễm ORT còn sống. Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Với những gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta lấy mẫu theo phương pháp sau:
Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70o để một thời gian cho dịch thấm vào tăm bông ─> Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau sau 2-8h. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
Đối với dịch khí quản hay phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào môi trường như trên, đậy nút, ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng các phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hoá học gây bệnh của vi khuẩn.
Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên các môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5µg/ml Gentamycin ở 37 oC, 5-10% CO2 trong 48 giờ. Căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt.
Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5% Gentamycin nuôi ở 37oC là những khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng. Không mọc trên môi trường Macconkey.
3.5.5. Phương pháp nhuộm Gram
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím gentians còn vi khuẩn Gram âm bắt mầu hồng của fucshin
Các bước tiến hành:
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản:
Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt mầu tốt hơn.
Bước 2: Nhuộm màu:
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô. Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
3.5.6. Phương pháp PCR
PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ gà mắc bệnh. Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA- polymerase phù hợp.
3.5.6.1. Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng
lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
3.5.6.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: Nội dung Thể tích (µl) Nuclease-Free Water 6,5 Master Mix 12,5 Reverse Primer 0,5 Forward Primer 0,5
Mẫu DNA tách chiết 5
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Charlton et al., 1993).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xuôi GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G
784bp
Mồi ngược TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu trình nhiệt:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.5.6.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 10ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung 10µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl marker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.5.7. Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được. khuẩn ORT phân lập được.
Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch.
Chủng vi khuẩn kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong vòng 24 – 48 giờ. Chuẩn bị đĩa thạch máu để tủ ấm 10 – 20 phút trước khi dùng. Lấy 0,1ml canh khuẩn cần kiểm tra nhỏ vào đĩa thạch và láng đều, sau đó để đĩa thạch từ 3 – 5 phút cho khô nhưng không để quá 25 phút. Sau đó dùng panh đặt và ấn nhẹ các khoang giấy đã tẩm các loại kháng sinh đặt cách nhau khoảng 15mm. Sau khi đặt các khoang giấy trên mặt thạch trong vòng 15 phút, lật úp đĩa thạch lại và đặt trong tủ ấm CO2 ở 37 oC. Đọc kết quả