3.5.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi nhiễm ORT còn sống. Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Với những gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta lấy mẫu theo phương pháp sau:
Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70o để một thời gian cho dịch thấm vào tăm bông ─> Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau sau 2-8h. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
Đối với dịch khí quản hay phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào môi trường như trên, đậy nút, ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng các phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hoá học gây bệnh của vi khuẩn.
Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên các môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5µg/ml Gentamycin ở 37 oC, 5-10% CO2 trong 48 giờ. Căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt.
Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5% Gentamycin nuôi ở 37oC là những khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng. Không mọc trên môi trường Macconkey.
3.5.5. Phương pháp nhuộm Gram
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím gentians còn vi khuẩn Gram âm bắt mầu hồng của fucshin
Các bước tiến hành:
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản:
Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt mầu tốt hơn.
Bước 2: Nhuộm màu:
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô. Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
3.5.6. Phương pháp PCR
PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ gà mắc bệnh. Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA- polymerase phù hợp.
3.5.6.1. Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng
lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
3.5.6.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: Nội dung Thể tích (µl) Nuclease-Free Water 6,5 Master Mix 12,5 Reverse Primer 0,5 Forward Primer 0,5
Mẫu DNA tách chiết 5
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Charlton et al., 1993).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xuôi GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G
784bp
Mồi ngược TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu trình nhiệt:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.5.6.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 10ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung 10µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl marker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.5.7. Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được. khuẩn ORT phân lập được.
Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch.
Chủng vi khuẩn kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong vòng 24 – 48 giờ. Chuẩn bị đĩa thạch máu để tủ ấm 10 – 20 phút trước khi dùng. Lấy 0,1ml canh khuẩn cần kiểm tra nhỏ vào đĩa thạch và láng đều, sau đó để đĩa thạch từ 3 – 5 phút cho khô nhưng không để quá 25 phút. Sau đó dùng panh đặt và ấn nhẹ các khoang giấy đã tẩm các loại kháng sinh đặt cách nhau khoảng 15mm. Sau khi đặt các khoang giấy trên mặt thạch trong vòng 15 phút, lật úp đĩa thạch lại và đặt trong tủ ấm CO2 ở 37 oC. Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ.
Dùng thước đo kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vòng vô khuẩn với bảng 3.1, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I) và kháng (R).
Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.
Đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoang giấy kháng sinh, đường kính được tính ra milimet. Đường kính này được chia thành các mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng tiêu chuẩn theo hướng dẫn trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn của nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh
Tên thuốc Ký hiệu kháng sinh
Hàm lượng kháng sinh
(µg)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) R I H 1. Amoxcicilin/ Clavulanic acid AMC 20/10 <13 14 – 17 >18 2. Ampicilline AMP 10 <11 12 – 13 >14 3. Tetracycline TE 30 <14 15 – 18 >19 4. Lincomycin L 15 <15 15 – 17 >17 5. Sulfamethoxazol – Trimethoprin SXT 23,75/1,25 <10 11 – 15 >16 6. Doxycilin DO 30 <13 14 – 16 >17 7. Erythromycin E 15 <13 14 – 22 >23 Nguồn: Ocoid từ NCCLS (1990) M2A4 (1982)
Ghi chú: H (High): mẫn cảm cao
I (Intermediate): mẫn cảm trung bình R (Resitant): kháng
Căn cứ vào tiêu chuẩn của từng loại kháng sinh để xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn:
- Vi khuẩn rất mẫn cảm với kháng sinh được đánh giá: +++ - Vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh: ++
- Vi khuẩn ít mẫn cảm với kháng sinh: +
3.5.8. Sử dụng một số loại kháng sinh để điều trị bệnh do ORT gây ra ở gà
Dựa vào khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được, lựa chọn loại kháng sinh có tỷ lệ mẫn cảm cao, tiến hành điều trị bệnh do ORT gây ra ở gà tại một số trại và hộ chăn nuôi thuộc huyện Ba Vì.
Đánh giá hiệu quả điều trị căn cứ vào tỷ lệ khỏi bệnh, thời gian điều trị khỏi trung bình.
Các loại kháng sinh được lựa chọn điều trị: Amoxicilline/clavulanic acid, Tetracycline và Erythromycin.
1. Erymar ( Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet)
Thành phần: Erythromycine 20g. Vitamin B1 5g. Tá dược vừa đủ 100g. Công dụng: Đặc trị viêm phổi, hen gà, khẹc vịt, suyễn lợn gây ho thở khò khè, vẩy mỏ, chảy nước mắt, ho hen lâu ngày. CRD, CCRD, bệnh sưng đầu ở gia cầm, bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm, bệnh viêm phổi – phế ở gia súc.
Cách dùng và liều lượng:
Gia cầm: 1g/6-8kg TT/ngày hoặc 1g/1,5 lít nước uống.
2. Tetracyclin (Hanvet)
Thành phần: mỗi gói chứa 100g Tetracyclin (dùng dạng Tetracycin hydroclorid)
Chỉ định: phòng và chữa các bệnh viêm phổi, màng phổi phế quản, nhiễm khuẩn máu, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, bệnh tụ huyết trùng, thương hàn, phân trắng, CRD,...
Cách dùng: pha với nước uống hoặc thức ăn Gia cầm 0,125g/lít nước uống hoặc 0.01-0.04g/gà.
3. Bio- Amox 500 (Biovet)
Công dụng: Bio – Amox 500 là kháng sinh có hoạt phổ rộng, hoạt lực mạnh với hàm lượng siêu đậm đặc nên tiêu diệt được hầu hết các loại vi khuẩn gây bệnh: Salmonella (thương hàn), E.coli, Coryza ( sưng phù đầu mặt), CRD, CCRD ( hen ghép tiêu chảy nặng), tụ huyết trùng, viêm nhiễm sinh dục, tiết niệu… Bio – Amox 500 rất an toàn cho gia súc sinh sản, gia cầm đẻ trứng.
Cách dùng: Gia cầm: 1g/4 lít nước sạch hoặc 1g/30kg TT
3.5.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu được trong thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel.
3.6. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3.6.1. Mẫu bệnh phẩm 3.6.1. Mẫu bệnh phẩm
Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm ORT thu thập được như: phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột, hạch…. Lấy ở các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội.
3.6.2. Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hay yếm khí tuỳ tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là 37oC, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 – 42oC. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường Tryptose soy agar và Chocolate agar. Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường Macconkey agar, Endo agar. Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kĩ như môi trường BHI, PB.
Môi trường ưu tiên sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn ORT là môi trường thạch máu Columbia Blood Agar bổ sung 5% máu cừu hoặc máu thỏ và 5µg/ml Gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Cách pha: cân chính xác 3,9g thạch máu Blood agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121 oC trong 30 phút, để nguội 45 – 50 oC sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hoà tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các chủng ORT đều kháng Gentamycin, nên cho thêm 10µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm. Sau đó đổ vào đĩa lồng (10 – 15 ml/ đĩa).
Hình 3.1. Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin 3.6.3. Các loại hoá chất
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p. Phenylenediamine hydrochloride.
- Thử phản ứng catalase: H2O2 3%
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac’s, nước trypton
- Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh. - Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA.
3.6.4. Máy móc
Tủ ấm, tủ -80 oC, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ lạnh bảo quản môi trường…
3.6.5. Dụng cụ
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA GÀ THẢ VƯỜN BA VÌ MẮC BỆNH DO ORT BỆNH DO ORT
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã tiến hành thu thập được tổng cộng 58 con gà nghi nhiễm ORT từ các trang trại gà thả vườn tại Ba Vì, Hà Nội (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm tại các địa phương
Nguồn gốc mẫu Số lượng mẫu
(con) Nhóm gà 3-6 tuần Gà thịt Gà đẻ Cẩm Lĩnh 16 7 3 6 Ba Trại 14 6 3 5 Thụy An 17 8 3 6 Cam Thượng 11 5 2 4 Tổng 58 26 11 21
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: các nhóm gà khác nhau thì nguy cơ nhiễm bệnh do ORT là khác nhau. Trong tổng số 58 mẫu (con) thu thập được có 26 con ở độ tuổi 3-6 tuần tuổi; 11 con gà đẻ và 21 con gà thịt. Như vậy, ta thấy