Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. HỆ THỐNG CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9
1.4.1. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa hệ gen
Chỉnh sửa hệ gen là công nghệ cho phép cải biến DNA hệ gen của sinh vật một cách chính xác và có chủ đích nhằm điều chỉnh chức năng của gen đích. Phương pháp này lợi dụng hệ thống sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những thay đổi nhỏ trong trình tự DNA đích, thơng qua việc sử dụng nuclease tổng hợp để tạo ra các đột biến đứt gãy DNA sợi đơi (double–stranded breaks – DSB) tại vị trí xác định trong hệ gen. Các đột biến này sẽ được tế bào sửa chữa thông qua một trong hai con đường: (1) sửa chữa ghép nối không tương đồng (non–homologous end– joining – NHEJ) hoặc (2) chèn thêm một trình tự DNA vào vị trí đứt gẫy theo cơ chế sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination – HR) (Hình 1.5). NHEJ được xác định là cơ chế sửa chữa DSB phổ biến nhất trong các tế bào thực vật. Cơ chế NHEJ hoạt động hiệu quả nhưng dễ xảy ra lỗi (sửa chữa khơng chính xác), trong khi cơ chế HR kém hiệu quả hơn nhưng có độ chính xác cao. Kết quả của q trình sửa chữa DBS có thể là sửa chữa chính xác hoặc xuất hiện các đột biến indel (thay thế, mất hoặc chèn gen), tùy vào con đường được sử dụng là HR hay NHEJ [10, 43].
ZFN (zinc finger nucleases) là một trong những công cụ chỉnh sửa gen lâu đời nhất, được phát triển vào những năm 1990 và thuộc sở hữu của Sangamo BioScatics. ZFN đã được sử dụng thành công trong việc chỉnh sửa bộ gen của nhiều loại cây khác nhau bao gồm thuốc lá, ngô, đậu tương… Tuy nhiên ZFN có một số nhược điểm như việc xây dựng các enzyme đích tốn nhiều thời gian và tốn kém, độ đặc hiệu thấp và đột biến ngoài mục tiêu cao. Sau đó, ZFN đã nhường chỗ
cho cơng nghệ mới – TALEN (transcription activator–like effector nucleases). TALEN là enzyme cắt DNA có thể dễ dàng được thao tác lập trình lại để nhận biết và cắt các chuỗi DNA cụ thể. Hệ thống này đã được sử dụng rộng rãi để tạo ra các đột biến không tương đồng với hiệu quả cao hơn trên nhiều đối tượng sinh vật. Tuy nhiên, sự xuất hiện của công nghệ CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein) với những ưu điểm vượt trội đã thay thế cả ZFN và TALEN để được sử dụng rộng rãi như một cách tiếp cận mới cho phép chỉnh sửa bộ gen trong các tế bào chủ của sinh vật nhân chuẩn. Sự ra đời của CRISPR/Cas đã thúc đẩy mạnh mẽ lĩnh vực chỉnh sửa gen trong cơng nghệ sinh học nói chung và sinh học thực vật nói riêng [10, 43].
Hình 1.5: Cơ chế sửa chữa đột biến đứt gãy DNA của tế bào [10]
Ghi chú: Các đứt gãy sợi đơi có thể được tế bào sửa chữa bằng cơ chế ghép nối không tương đồng (NHEJ) (A) hoặc tái tổ hợp tương đồng (HR) (B). Sửa chữa theo
cơ chế NHEJ có thể tạo ra đột biến dị hợp tử, đột biến song song (hai đột biến khác nhau ở mỗi nhiễm sắc thể hoặc đột biến đồng hợp tử (hai đột biến độc lập giống hệt nhau) dẫn đến bất hoạt gen. Sửa chữa theo cơ chế HR (với sự hiện diện của “DNA cho” có thể tạo đột biến chính xác hoặc chèn gen.
Hình 1.6: Mơ hình hoạt động của các hệ thống chỉnh sửa hệ gen [10]
Ghi chú: Mơ hình hoạt động khái quát của hệ thống ZFN (A), TALEN (B) và CRISPR/Cas9 (C).