Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ HỆ VECTOR CHUYỂN GEN
1.5.1. Phương pháp chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Chuyển gen ở thực vật là quá trình đưa vật liệu di truyền (DNA) ngoại lai vào trong hệ gen thực vật nhằm tạo ra một tính trạng nhất định mà trước đó thực vật khơng có. Q trình chuyển gen này được coi là thành công khi gen chuyển kết hợp ổn định với DNA hệ gen tế bào thực vật được chuyển nạp. Tế bào này sau đó được tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen chuyển và duy trì ổn định trong các thế hệ sau. Vật liệu trong chuyển gen thực vật thường là phôi non, phôi trưởng thành, mô sẹo (từ các nguồn gốc khác nhau), mô lá hay thân mầm… Phương pháp chuyển gen vào thực vật có thể là gián tiếp (thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens hoặc A. rhizogenes) hay trực tiếp (bằng súng bắn gen, xung điện, PEG – polyethylene glycol, vi tiêm, dung hợp tế bào trần…). Trong đó, chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất cho đến nay.
Trong tự nhiên, vi khuẩn đất A. tumefaciens không tự sản xuất được một số acid amin như octopin, nopaline. Để tồn tại, vi khuẩn này xâm nhiễm vào nhiều lồi thực vật (thơng qua các vết tổn thương) để chuyển gen của nó vào hệ gen thực vật, nhờ thực vật sản xuất ra một số chất cần thiết cho vi khuẩn sử dụng. Quá trình chuyển gen của A. tumefaciens diễn ra nhờ một loại plasmid đặc biệt gây nên tình trạng khối u tại vị trí xâm nhiễm trên cơ thể thực vật, gọi là Ti–plasmid (tumor–inducing plasmid). Một phần của Ti–plasmid, gọi là T–DNA (transfer–DNA), có chứa các gen cần chuyển được truyền vào tế bào thực vật và chèn vào hệ gen trong nhân nhờ một hệ enzyme đặc trưng của vi khuẩn. Nhờ đặc tính này mà Ti–plasmid của A. tumefaciens
đã được cải biến để sử dụng làm vector truyền các gen ngoại lai vào nhiễm sắc thể thực vật. Phương pháp này đạt hiệu quả cao đối với nhiều đối tượng thực vật hai lá mầm nhưng có nhược điểm là hiệu suất chuyển gen trên các đối tượng cây một lá mầm hay cây thân gỗ rất thấp [70]. Các cấu trúc DNA biểu hiện CRISPR/Cas9 cũng thường được đưa vào tế bào thực vật nhờ A. tumefaciens do nó có xu hướng chèn chỉ một hoặc một vài bản sao của gen chuyển, đồng thời thao tác đơn giản và khơng địi hỏi các máy móc (như súng bắn gen) đắt tiền [43].
1.5.2. Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật
Cấu trúc của Ti–plasmid tự nhiên bao gồm hai thành phần quan trọng là vùng T– DNA và vùng gây độc vir (vilurence region). Vùng T–DNA là đoạn DNA được chuyển vào tế bào chủ được giới hạn bởi 2 trình tự đặc trưng trên Ti–plasmid, gọi là bờ phải (right border – RB) và bờ trái (left border – LB). Vùng gây độc vir là vùng trình tự chứa 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, có vai trị kích thích việc biến nạp của T–DNA. Trong đó virA, virB, virD và virG có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp vào tế bào thực vật; virC, virE, virF và virH có tác dụng tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gen. Ngoài ra, Ti–plasmid tự nhiên cịn chứa trình tự khởi đầu tái bản (Origin) để sao chép trong tế bào chủ và gen mã hóa cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism).
Ti–plasmid tự nhiên đã được các nhà khoa học cải biến bằng cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại vùng vir và phần T–DNA tối thiểu.
Vùng vir là vùng đảm nhiệm chức năng vận chuyển T–DNA vào tế bào thực vật.
Phần T–DNA tối thiểu là vùng mang trình tự khởi đầu tái bản (Origin), vùng đa điểm cắt (multiple cloning site – MCS) chứa trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn, trình tự điều hịa (promoter) điều khiển sự phiên mã của gen đích, trình tự kết thúc phiên mã (terminator). Đồng thời Ti–plasmid được thiết kế đưa thêm vào các gen chọn lọc/chỉ thị giúp sàng lọc thể biến nạp mang Ti–plasmid. Các gen chọn lọc được sử dụng phổ biến là gen kháng kháng sinh như KanR, NeoR, HygR… mã hóa cho các enzyme xúc tác phản ứng photphoryl hóa chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt, giúp chọn lọc trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật. Các gen GusA, LacZ,
cho các enzyme phân giải cơ chất và chuyển cơ chất từ không màu thành màu đặc trưng giúp cho việc nhận biết sự có mặt và đánh giá sự biểu hiện của cấu trúc chứa gen ngoại lai trong các thể biến nạp. Người ta đưa gen cần chuyển vào Ti–plasmid, sau đó biến nạp vào A. tumefaciens để lây nhiễm lên mơ thực vật. Theo đặc tính vốn có, vi khuẩn sẽ chuyển các gen vào tế bào thực vật. Như vậy việc chuyển gen được hoàn thành, nhiệm vụ của người thực nghiệm là tái sinh tế bào/mơ thành cây, sau đó kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở cây tái sinh [70, 71].
Các vector nhị phân chuyển gen thực vật thường được thiết kế sẵn cấu trúc biểu hiện gen với vùng promoter và terminator khác nhau tùy vào đối tượng và mục đích sử dụng. CaMV35S và Ubiquitin là 2 cấu trúc promoter được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen trong tế bào thực vật, được phân lập từ cauliflower–mosaic virus (CaMV) và ngơ). Trình tự terminator được sử dụng phổ biến là Nos–polyA – là đầu 3’ không mã hóa của gen mã hóa enzyme nopaline synthase được phân lập từ A. tumefaciens đã được thiết kế bổ sung trình tự tín hiệu kết thúc phiên mã đặc trưng ở sinh vật nhân chuẩn. Ngoài ra, tuỳ từng mục đích thí nghiệm cụ thể, các cấu trúc promoter đặc trưng sẽ được thiết kế riêng. Ví dụ như các promoter hoạt động đặc hiệu trong các điều kiện nhất định/các mơ đặc trưng, các trình tự polypeptide dung hợp với protein đích…[70].
1.5.3. Vector chỉnh sửa gen trong tế bào thực vật
Các vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen trong tế bào thực vật có bản chất là Ti– plasmid nhân tạo mang đầy đủ các thành phần cơ bản và được thiết kế thêm cấu trúc biểu hiện gen đích, bao gồm 2 phần: (1) cấu trúc biểu hiện sgRNA và (2) cấu trúc biểu hiện Cas9.
Một sgRNA điển hình chứa 98 Nu (bao gồm chuỗi mục tiêu 20 Nu – crRNA) và hoạt động như một hướng dẫn trong phức hợp nuclease Cas9/sgRNA). Sự biểu hiện của sgRNA ở thực vật, nói chung, thường được điều khiển bởi promoter U3 hoặc
U6, và sgRNA được phiên mã bởi RNA polymerase III. Do cấu trúc [U3/U6: sgRNA]
có kích thước nhỏ (300 – 600 bp), nên có thể sử dụng phương pháp nối adapter vào trình tự đích (target–adaptor ligation) hoặc PCR để tạo ra các cấu trúc biểu hiện sgRNA mang chuỗi crRNA đặc trưng.
Bảng 1.2: Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen ở thực vật [43]
Đối tượng Promoter
cho Cas9 Promoter cho sgRNA
Phương pháp chuyển gen/vật liệu
Oryza sativa
2 × P35S OsU3 Súng bắn gen/mô sẹo
AtU6–26 A. tumefaciens/mô sẹo
OsUbi OsU3
A. tumefaciens/mô sẹo OsU6.1, OsU6.2
ZmUbi OsU3, OsU6a, OsU6b, OsU6c Arabidopsis thaliana AtUbi AtU6 A. tumefaciens/nhúng chìm hoa
AtU6, AtU3b, At7SL PcUbi AtU6–26 2 × P35S AtU6–26, AtU6–29 AtU3b, AtU3d, AtU6–1, AtU6–29 ICU2 AtU6
EC1 AtU6–26, AtU6–29 Nicotiana
benthamiana
P35S AtU6
Agro-infiltration/mơ lá
2 × P35S AtU6–26
Zea mays ZmUbi OsU3, TaU3 A. tumefaciens/phôi non
ZmU6 Súng bắn gen/phơi non
Solanum
tuberosum 2 × P35S StU6 A. tumefaciens/đoạn thân
Trình tự mã hóa của gen Cas9 có độ dài 4107 bp. Ở sinh vật nhân chuẩn, protein Cas9 địi hỏi có hợp nhất đơn hoặc kép với tín hiệu định vị hạt nhân (nuclear localization signal – NLS) để có thể hoạt động hiệu quả. Để tăng cường biểu hiện gen
Cas9 ở thực vật, hầu hết các gen Cas9 được sửa đổi để tối ưu hóa với các mã bộ ba
đặc trưng cho thực vật. Nhìn chung, các promoter như Ubiquitin hay CaMV35S, có thể đáp ứng yêu cầu điều khiển gen Cas9 cả trong cây một lá mầm và hai lá mầm. Trong nhiều trường hợp, promoter Ubiquitin được chứng minh là tạo ra hiệu quả